芥菜型油菜抗虫转基因植株及其后代株系的研究

带有１ ～２ ｍ ｍ 子叶柄的芥菜型油菜子叶经农杆菌感染后,培养在附加１０ ～２０ ｍｇ／ Ｌ卡那霉素的 Ｍ Ｓ 选择培养基上筛选转化愈伤组织及不定芽。卡那霉素抗性苗相继在含３０ ～５０ ｍ ｇ／ Ｌ 卡那霉素的选择培养基上继代培养,再转移到含２０ ｍｇ／ Ｌ 卡那霉素的生根培养基上诱导生根。以苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因为探针,进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分子杂交,得到阳性结果。 Ｐ Ｃ Ｒ 分析也证明外源基因整合到油菜基因组并稳定传递到后代。转基因植株的抗虫性和卡那霉素抗性在自交后代中得到保持,筛选得到纯合的转基因植株后代株系     

甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析

通过油菜子叶外植体－农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜,获得抗虫的转基因植株。带有１￣２ｍｍ子叶柄的油菜子叶经农杆菌感染后,共培养２￣３天,然后转移到附加１５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ选择培养基上筛选转化愈伤组织及不定芽。卡那霉素抗性苗相继在含２０￣５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的选择培养基上继代培养,再转移到含２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的生根培养基上诱导生根。以苏云金杆菌杀虫蛋白基因为探针,进行１     

GUS基因在梨转化植株中的稳定表达

以获得的梨转GUS基因植株的试管苗为试材,转基因植株的叶片在含卡那霉素的再生培养基上可成功再生不定梢,这些不定梢在含卡那霉素的生根培养基上可诱导生根。再生不定梢经组织化学检测仍表现出GUS基因的表达。而非转基因植株的叶片在含卡那霉素的再生培养基上不能产生不定梢,显示外源基因在转基因植株中的表达在无性繁殖后代中是稳定遗传的。     

抗虫转基因甘蓝及其后代的研究

通过农杆菌感染法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因转移进了甘蓝的基因组,带子叶柄的子叶作为外植体与农杆菌共培养.发生在子叶柄基部的愈伤组织在含卡那霉素(Km)15～30mg/L的MS培养基上进行筛选,约5%外植体上的愈伤组织继续长大,当移到含Km和6-BA的分化培养基上时,愈伤组织分化出绿色的芽.将芽分离培养,约80%在加有Km的培养基上被诱导生了根.未转化的对照组织在筛选培养基上不能分化出正常的芽和根系,并且逐渐褐化死亡.小菜粉蝶的幼虫被饲喂以转基因植株的叶片,幼虫出现中毒症状,表现为发育受阻和死亡.约20%受试植物的DNA与苏云金杆菌杀虫蛋白基因探针杂交显阳性带.由转基因植株的种子长成的第2代甘蓝幼苗的卡那霉素抗性和植株的抗小菜粉蝶的活力均符合孟德尔单基因分离规律.     

ACC合成酶基因及其反义基因对西瓜的遗传转化

以2日龄西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld)无菌苗子叶为外植体,通过与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行叶盘共培养建立了西瓜的遗传转化系统。所用根癌农杆菌中含有改建后分别携带嵌合NPTⅡ基因和番茄的ACC合成酶基因及其反义基因的质粒。外植体在MSA培养基(MS盐类、B_5维生素、1.0mg/L BA、0.2mg/L IAA)上预培养3～4d后,与根癌农杆菌共培养4d,随后转移外植体至附加100mg/L卡那霉素、300mg/L头孢菌素的MSA培养基上筛选转化芽。将带芽外植体移入含有100mg/L卡那霉素、300mg/L头孢菌素的伸长培养基(MS 0.2mg/L KT)上进行芽伸长,切取2～3cm高的伸长芽移入生根培养基(1/2MS 0.1mg/L NAA)生根。Southern blot结果证明获得转基因植株,乙烯释放指标表明转入的正义和反义ACC合成酶基因得到不同程度的表达。     

石斛兰转ACS反义基因抗性原球茎及转化植株的筛选与鉴定

该试验就石斛兰转化ACS(1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶)反义基因的不同筛选方法和筛选处理对抗性原球茎筛选的影响,以及石斛兰转基因植株的再生与鉴定进行研究.结果表明:(1)石斛兰原球茎经带有gus报告基因和ACS反义基因的农杆菌LBA4404侵染共培养5d后除菌,采用逐渐提高选择压浓度的延迟筛选,并在低选择压浓度下切割而高选择压浓度下不切割的处理方式为抗性原球茎的最佳筛选途径,抗性原球茎获得率可达14.97％.(2)抗性原球茎繁殖时应逐渐降低选择压浓度,且在低选择压浓度下进行切割处理,繁殖倍数达到1.15倍,且原球茎生长势好.(3)抗性原球茎在1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA培养基中的分化率达到73.85％;107株无根小苗培养于1/2 MS+1.0 mg/L NAA+50.0 mg/L Km(卡那霉素)+100.0 mg/L Cef(头孢霉素)培养基中进行生根培养,共获得了13株具有卡那霉素抗性的转化植株,转化效率达到12.15％.(4)转化植株经报告基因产物GUS组织化学检测和gus的PCR检测,证实带ACS反义基因的T-DNA已整合进石斛兰基因组中,且转基因植株在形态上与未转基因植株无明显差别,3株转基因植株移栽2个月后均已成活.     

转TaLEA1基因丹参植株的耐盐与耐旱性

TaLEA1基因是一个从小麦中克隆得到的编码胚胎晚期丰富蛋白的基因,用农杆菌EHA105（含卡那霉素抗性基因表达载体PBI121-TaLEA1）介导的叶盘转化法将其转入丹参（Salviamiltiorrhiza Bunge）组织培养苗中,在50mg/L卡那霉素选择压下连续筛选,并扩繁和生根培养,获得了7个丹参转基因株系。经PCR扩增,初步验证得到6个阳性株系,再继代4次后,Southern杂交结果表明已获得了一个能稳定遗传的转基因株系。该株系在含1%NaCl和8%PEG6000培养基中的生长状态优于野生型,表明转入TaLEA1基因可改善丹参组培苗的耐盐和耐旱性。     

根癌农杆菌对健康和患丛枝病泡桐的遗传转化

选取健康及患丛枝病泡桐（Paulownia spp.)为材料,建立组织培养和植株再生系统,以茎段作为转化受体,诱导分化和生根的最佳激素组合分别是MS＋BA4mg/L NAA0.2mg/L和1／2MS＋KT0.5mg/L IBA0.25mg/L。芽分化频率可达22．8％。健康和患病泡桐的茎段经农杆菌共培养3d后,在附加50mg/Lm的选择分化培养基上培养20d左右再生出抗性芽,经培养、诱导生根,获得了转基因再生植株,建立了泡桐的遗传转化体系。PCR和Southern杂交检测证明外源基因已整合到泡桐的基因组,标记基因ITPⅡ在再生植株中也得到表达,同时对影响转化的一因素进行了探讨。     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因植株再生的研究

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ti质粒转化材料,利用共培养法将苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现:80μmol/L的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可将转化效率提高50倍。OD值为0.8的农杆菌菌液稀释8—10信后与在G培养基预培养10天的胚性愈伤组织共培养2—3夭,Ti质粒对葡萄愈伤组织细胞的转化效率可达50%左右。筛选得到的转基因植株在含Km 30 mg/L的选择培养基上继代存活6个月,生长正常;提取叶片染色体DNA做Southern blot,杂交结果为阳性。将转基因植株各部分切段置于含Km 50 mg/L的选择培养基上,能够脱分化产生抗性愈伤组织并能增殖。     

转TaDREB基因提高芦荟抗低温特性的研究

以库拉索芦荟(Aloe vera L.)幼茎为外植体,利用农杆菌介导法将携带小麦功能基因TaDREB的表达载体pBIR1转化库拉索芦荟,在添加3.0mg/L BA、250mg/L Carbenicillin和15~25mg/L G418的MS培养基上诱导、筛选丛生芽,连续筛选几代后,将2.0~3.0cm高的抗性再生芽转移到1/2MS生根培养基上壮苗,共获得58株生长良好的抗性植株。根据标记基因npt Ⅱ及目的基因TaDREB的序列设计上游引物,对所有抗性植株进行PCR检测,共获得3株PCR阳性植株,结果表明目的基因的转化效率为0.5%。将转基因阳性植株置于4℃低温处理2周,20℃冷冻处理30min,发现对照植株发生严重冻害,而转基因植株生长良好,抗低温特性明显提高。对低温胁迫条件下培养14天的转基因植株SOD、POD酶活性进行分析,结果表明低温胁迫下转基因植株SOD、POD活性均呈降－升－升－升趋势变化,与非转基因植株的变化趋势降－升－降－降有所不同。进一步利用电导率法检测,结果转基因植株电导率的平均值为0.456,明显低于对照的0.685;说明转基因芦荟细胞膜的稳定性得到很好的改善,是其抗低温特性提高的内在生理基础。     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆.从发芽5-7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体,经农杆菌浸染和共培养后,在含50 mg/L卡那霉素的选择培养基上培养2-4w后,从子叶节处诱导出抗性不定芽.将不定芽转移到伸长培养基上,4-6w后长至2-3em高的再生苗.再将再生苗切下转入生根培养基,2-6w生根.生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中,部分移栽成活的T0植株能正常开花结荚.从T0植株上收获T1种子,按株系种植.T0和T1代经PCR检测和DNA分子杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组内并能遗传给后代.     

深黄被孢霉Δ6—脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽5—7d的大豆菌苗切取子叶节外植体,经农杆菌浸染和共培养后,在含50mg/L卡那霉素的选择培养基上培养2-4w后,从子叶节处诱导出抗性不定芽,将不定芽转移到伸长培养基上,4-6w后长至2-3cm高的再生苗,再将再生苗切下转入生根培养基,2-6w生根,生根后的再生植株经逐渐锻炼移入花盆中,部分移栽成活的T0植株能正常开花结荚。从T0植株上收获T1种子,按株系种植。T0和T1代经PCR检测和DNA分子杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组内并能遗传给后代。     

高效烟草遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

以烟草无菌茁叶片为外植体,通过根癌农杆菌LBA4404介导法,将Thamnatin基因导人烟草中,经梯度卡那霉素(Kana-mycin,Km)筛选,获得可在含75mg／L、100mg／L Km选择生根培养基上再生的抗性植株,其中部分Km抗性植株经PCR检测为阳性,转化率为31．3％,初步鉴定已成功地建立了烟草遗传转化系统,为进一步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况奠定基础。     

干旱耐逆基因（HS1）转化甘薯获得转基因植株

以甘薯（1pomoeabatatas（L.）Lam．）品种栗子香的胚性悬浮细胞为受体材料,用根癌农杆菌介导法,获得了表达除草剂抗性基因bar基因的转HSl基因甘薯植株。共计380个遗传转化的胚性细胞团,在添加2mg／L2．4-D、100mg／L Carb和10mg／L Glu（glufosinate）的固体Ms培养基上选择培养9周后,得到了12个Glu抗性愈伤组织。将这些抗性愈伤组织转移到添加1mg／L ABA、100mg／L羧苄青霉素和10mg／L Glu的固体MS培养基上,其中的3个抗性愈伤组织再生出拟转基因植株。PCR鉴定它们为转基因植株。Southern blot分析表明,HS1基因已整合到基因组中。转基因植株具有稳定的除草剂抗性。结薯观察实验结果表明,转基因植株结薯正常。     

带内含子卡那霉素抗性基因双元载体构建及烟草转化

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率。将一个植物的内含子插入卡那霉素抗性基因编码区的N端,合成了一个带内含子的卡那霉素抗性基因。构建带该基因的植物双元表达栽体pYP1202并转化烟草,受侵外植体在含卡那霉素50～200mg/L的选择培养基中抗性芽分化频率不受卡那霉素浓度影响,然而具有GUS活性的转化子占分化芽的比例却随着卡那霉素浓度的增加而升高。当培养基中加入500mg/L羧苄青霉素后受侵外植体产生的抗性芽频率比单一的卡那霉素筛选提高近1倍,高达91.4％,然而具GUS活性的转化子占抗性芽的比例仅有26.7％,在200m/L的卡那霉素筛选下,比例升至93.3％。用带内含子卡那霉素抗性基因构建的植物表达载体转化植物可以减少假抗性芽的产生。     

转甜瓜CmSAMDC基因拟南芥的获得及其耐盐性研究

该研究以哥伦比亚生态型野生拟南芥为材料,将甜瓜CmSAMDC基因构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导法转入拟南芥,在含有50mg/L潮霉素(Hyg)MS固体培养基上筛选转基因后代,并利用T3代转基因幼苗进行耐盐性分析。结果显示:(1)成功构建了植物超表达载体35S∷CmSAMDC,并经农杆菌介导法转化拟南芥,潮霉素抗性筛选后获得了转CmSAMDC基因拟南芥T3代植株。(2)转CmSAMDC基因拟南芥T3代幼苗在含100、150、200mmol/L NaCl培养基中,侧根长势比野生型植株更为健壮;在200mmol/L NaCl浇灌处理后,转CmSAMDC基因T3代植株仍能维持正常生长,而野生型植株的生长明显受到抑制;在400mmol/L NaCl浇灌处理后16d,野生型植株逐渐死亡,而转基因植株仍能继续存活;对盐胁迫后植株的脂质过氧化程度(MDA)测定显示,野生型植株MDA水平较转基因植株上升更为明显。研究表明,过表达甜瓜CmSAMDC基因增强了转基因拟南芥的耐盐性。     

带内含子卡那霉素抗性基因双元载体构建及烟草转化

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率,将一个植物的内含子插入卡那霉素抗性基因编码区的N端。合成了一个带内含子的卡那霉素抗性基因。构建带该基因的植物双元表达载体pYP1202并转化烟草,受外植体在含卡那霉素50－200mg/L的选择培养基中抗性芽分化频率不受卡那霉素浓度影响,然而具有GUS活性的转化子占分化芽的比例却随着卡那霉素浓度的增加而升高。当培养基中加入500mg/L羧苄青霉素后受侵外植体产生的抗性芽频率比单一的卡那霉素筛选提高近1倍,高达91.4％,然而具GUS活性的转化子占抗性芽的比较仅有26.7％,在200mg/L的卡那霉素筛选下,比例升至93.3％。用带内含子卡那霉素抗性基因构建的植物表达载体转化植物可以减少假抗性芽的产生。     

反义磷脂酶Dγ(Anti-PLDγ)基因转化美洲黑杨G2的研究

通过农杆菌介导法将反义磷脂酶DT(Anti-PLDγ)基因转入美洲黑杨G2中以提高其耐盐性。本研究建立了美洲黑杨G2组培再生体系,确立了美洲黑杨G2叶片分化最适宜培养基和生根培养基,进行了卡那霉素(选择性抗生素)敏感性试验,改良了传统的农杆菌介导转化法。经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株,抗性植株经PCR及PCR-Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti-PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。耐盐性实验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照有不同程度提高。     

转抗虫基因三倍体毛白杨植株体内农杆菌残存与逃逸

用部分改造的 BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂(API-A)基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法对三倍体毛白杨进行了转化,对转化后植株体内残存农杆菌在继代培养和移栽过程中进行了跟踪检测。结果表明：通过对转化再生植株的分子生物学检测,42个株系中,33个株系为阳性,阳性率达到80％;用Bt毒蛋白抗血清进行ELSA检测结果表明,7个转基因株系都有Bt杀虫蛋白表达;基因转化后,可采用附加50 mg/L卡那霉素,300 mg/L羧青霉素的筛选培养基消除细菌并进行抗性芽筛选。对28个转基因株系叶片、茎段和根段在含有卡那霉素50 mg/L YEB培养基上进行细菌培养,通过在T-DNA区、质粒Vir区和农杆菌基因组设计引物,进行PCR检测,证明有3个株系（33、37、5号）检测到残存工程农杆菌,并在组培瓶中存活24个月。将带菌的3个株系组培苗移栽到花盆中,室内培养1个月后,在33号株系根际土壤中检测到了目的农杆菌。     

农杆菌介导LJAMP2基因导入‘红阳’猕猴桃及分子鉴定

为了获得抗溃疡病的‘红阳’猕猴桃转基因植株,以红阳猕猴桃试管苗叶盘为转基因受体材料,通过根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的LJAMP2基因导入红阳猕猴桃。450个叶盘与携带表达载体质粒pBI121的根癌农杆菌菌珠LBA4404共培养2 d后,转入含25 mg/L Kan的筛选培养基培养40 d,15 d转接1次,之后30 d继代1次。结果表明,在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA筛选培养基中,Kanr芽率达85%以上,在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培养基中,Kanr芽生根率达100%。共获得Kanr再生植株40株,经GUS组织染色和PCR分析证明,其中23株为转基因植株。阳性率为57.50%,转化率达5.11%。抗溃疡病基因LJAMP2已成功导入红阳猕猴桃,为红阳猕猴桃的抗病基因工程育种奠定了基础。