基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对阪崎克罗诺杆菌的鉴定及溯源

目的研究不同样品前处理方法对VITEK~?基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(VITEK~?MALDI-TOF MS,以下简称VITEK MS)鉴定阪崎克罗诺杆菌的影响及该方法对阪崎克罗诺杆菌的分型溯源能力,研究VITEK MS与MALDI 7090~(TM)MALDI-TOF/TOF MS(以下简称MALDI 7090)所得图谱的异同。方法选取3种不同样品前处理方法处理18株阪崎克罗诺杆菌野生菌株、2株阪崎克罗诺杆菌标准菌株和2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株,比较VITEK MS鉴定结果与传统鉴定结果的一致性;通过VITEK MS的鉴定结果和图谱的比对,研究不同样品前处理方法对阪崎克罗诺杆菌鉴定的影响;利用VITEK MS质谱图特征峰的聚类分析,对20株阪崎克罗诺杆菌进行溯源研究;同时比较VITEK MS与MALDI 7090所得图谱,研究两者的异同。结果 20株试验菌株的VITEK MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌,与传统的鉴定结果一致,并与2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株能明显地区分;3种不同样品前处理方法得到的鉴定谱图与标准谱图比对获得的鉴定结果可信度之间差异无统计学意义(P0.05),但质谱图中质谱峰数量和相对峰强度有明显差异,其中甲酸提取法在2 000~15 000 m/z范围内,相对峰强度5 m V的质谱峰数量达15个以上。在相似水平为80%的条件下,VITEK MS的聚类分析将甲酸提取法的20株阪崎克罗诺杆菌分为5个群,通过聚类分析及菌株来源能够推测阪崎克罗诺杆菌传播途径。VITEK MS和MALDI 7090得到的谱图,两者特征峰的出峰位置与相对峰强度无明显差异。结论 MALDI-TOF MS技术可以准确鉴定阪崎克罗诺杆菌;甲酸提取法更适用于阪崎克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS鉴定;MALDI-TOF MS技术对阪崎克罗诺杆菌的溯源研究具有重要价值;VITEK MS与MALDI 7090所得谱图无明显差异。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与VITEK和rpoB基因测序三种方法对食品中葡萄球菌鉴定效果的比较

目的 比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、rpoB基因测序和VITEK 2 Compact三种方法对葡萄球菌的鉴定效果。方法 同时采用三种方法对实验室保存的从食品中分离的59株葡萄球菌进行鉴定。结果 MALDI-TOF MS法和rpoB基因测序法一致性达100.00%,与VITEK 2 Compact法的一致性为83.05%(49/59)。7株菌因超出VITEK 2 Compact鉴定范围而鉴定错误。MALDI-TOF MS法可快速将59株菌准确鉴定为17种葡萄球菌,鉴定分值与细菌种类相关。金黄色葡萄球菌的鉴定分值最高(>2.300),松鼠葡萄球菌、鱼发酵葡萄球菌和琥珀葡萄球菌的鉴定分值相对较低(1.700～2.000)。结论 相比rpoB基因测序法和VITEK 2 Compact法,MALDI-TOF MS法更加快速准确。为达到更好的鉴定效果,现有数据库仍需进一步优化。     

克罗诺杆菌MALDI-TOF-MS数据库的建立及应用

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术建立了克罗诺杆菌MALDI-TOF-MS数据库,用于该菌属内种和亚种的高通 量鉴定及菌株分型。在优化培养条件、样品处理方法及确定MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱采集参数的基础上, 将采集的8 种参考菌株蛋白质质谱数据通过Biotyper软件构建克罗诺杆菌的MALDI-TOF-MS数据库,再用相近肠杆 菌及该属分离株验证数据库的准确性。结果表明：应用建立的克罗诺杆菌的MALDI-TOF-MS数据库对135 株克罗 诺杆菌分离株进行分析,鉴定分值均不小于2.0,达到了种水平鉴定要求,通过聚类分析,可进一步分型。构建的 MALDI-TOF-MS数据库为克罗诺杆菌高通量鉴定与分型提供了一种新的手段。     

6种克罗诺杆菌精准鉴定及标准物质的制备研究

目的 制备具有我国食源性特点的6种克罗诺杆菌检验用标准物质。方法 通过生化、MALDI-TOF MS及二代高通量全基因组测序技术对研究用菌株进行菌种鉴定确认后,制备104 CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS-GL003等标准要求对样品进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。将样品放于25 ℃和37 ℃及-20 ℃、4 ℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据国家标准GB 4789.40,将研制的6种标准物质分别加入20件乳粉样品中进行检验,检测真实食品样品中适用性。组织3家实验室,对6种标准物质进行协作标定。结果 CMCC45413、CMCC45410、CMCC45414、CMCC45412、CMCC98025及CMCC45408生化鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌属(Cronobacter sakazakii group),准确度为92%至99%;MALDI-TOF MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）,分数为1.914至2.244;全基因组测序鉴定结果与菌株已知种或亚种信息一致。均匀性测试结果符合正态分布,通过单因子方差分析,6种标准物质F值分别为0.422、0.922、0.980、0.409、0.721及0.631,F＜F0.05,符合均匀性要求。25 ℃及37 ℃ 放置7 d,6种标准物质中菌含量仍保持在104 CFU/样品。6种标准物质放置于4 ℃储存28 d及放置于-20 ℃储存90 d,菌含量均为104 CFU/样品,且存活率均在80%以上。20件真实乳粉样品中分别加入6种克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出;经3家实验室协作标定,6种克罗诺杆菌标准物质浓度均为104 CFU/样品。结论 本研究制备的6种克罗诺杆菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于婴幼儿乳粉中克罗诺杆菌的检验。     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

金黄色葡萄球菌基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱的鉴定与聚类分型

目的 建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption lonization-time of flight mass spectrometer, MALDI-TOF MS)快速鉴定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)并自建数据库, 进行聚类分型。方法 基于MALDI-TOF MS技术, 对经全自动微生物分析仪(VITEK2 COMPACT)鉴定为S. aureus的25株分离株和1株标准菌株(ATCC 25923)进行鉴定。并进一步采集26株S. aureus特征性蛋白质指纹图谱, 使用flex Analysis软件进行分析, 汇总成标准图谱并构建本地分离株S. aureus的鉴定数据库, 命名为Staphylococcus aureus。结果 经标准菌株ATCC 25923验证, 自建数据库对S. aureus鉴定结果的可信度较设备自带数据库明显提高, 鉴定分值由2.251提高到了2.845。自建数据库进一步对26株S. aureus进行聚类分型, 在差异水平100时, 24株不同来源S. aureus被聚类成24个分支, 将食品中不同来源分离的S. aureus分为24个型。结论 MALDI-TOF MS作为一种快速、准确、高通量的全新微生物鉴定技术, 实现了对S. aureus的特异性快速鉴定与分型, 能够满足公共安全卫生、突发食品安全事件和口岸快速通关方面的需求。     

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定产气荚膜梭菌

分别采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、16S rRNA基因测序、VITEK 2 COMPACT和传统生化方法(牛乳汹涌发酵实验)鉴定实验室保存的51株产气荚膜梭菌,以评估MALDI-TOF MS方法是否适用于产气荚膜梭菌的快速鉴定。MALDI-TOF MS方法将51株菌均鉴定为产气荚膜梭菌且鉴定分值在2. 300以上,达到鉴定到种的要求。16S rRNA基因序列比对结果与MALDI-TOF MS方法结果一致。VITEK 2 COMPACT将49株菌鉴定为产气荚膜梭菌,2株菌未能成功鉴定。47株菌的牛乳汹涌发酵实验呈阳性,4株菌为牛乳汹涌发酵实验阴性,且这4株菌经其他3种方法均鉴定为产气荚膜梭菌。结果表明,无论是牛乳汹涌发酵实验还是VITEK 2 COMPACT,在检测产气荚膜梭菌时都有可能发生漏检。相比牛乳汹涌发酵实验、VITEK 2 COMPACT和16S rRNA测序方法,MALDI-TOF MS方法更加快速、准确和低成本,适用于产气荚膜梭菌的快速鉴定。     

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法溯源分析云南省肉制品中金黄色葡萄球菌

目的 利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术对云南省肉制品中金黄色葡萄球菌进行溯源。方法 通过MALDI-TOF MS, 主成分分析及聚类分析等方法, 对来源于云南省肉制品的88株金黄色葡萄球菌, 包括耐苯唑西林或敏感金黄色葡萄球菌株(MRSA/MSSA)的进行溯源研究。结果 86株金黄色葡萄球菌可鉴定到种的水平, 2株可鉴定到属的水平。用MALDI-TOF MS鉴定金黄色葡萄球菌与生化和血清学方法的分型高度相关, 聚类分析表明, 88株菌株在距离水平为500的情况下被划分为4个类型, 其中5型同数据库中来自欧美的9株标准菌株亲缘关系最近。88株金黄色葡萄球菌中来源相同地区的菌株MALDI-TOF MS肽指纹图谱相似性较好, 相同类别来源或地区来源的金黄色葡萄球菌菌体蛋白表达更为相似, MRSA和MSSA菌株MALDI-TOF MS肽指纹图谱未观察到显著差异。结论 MALDI-TOF MS是一种快速、高敏感、高通量、高精度的金黄色葡萄球菌鉴定技术, 具有良好的可追溯性。     

柠檬酸杆菌属基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图谱库的扩展及效果评价

目的 扩展基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)中柠檬酸杆菌属数据库。方法 PCR方法扩增并测序管家基因leuS进行系统发育分析鉴定菌种；平行对照试验优化菌株培养和样品制备条件；按照自建库方法手动采集优化培养后菌株谱图,构建实验室内部数据库,并进行灵敏度与特异度评价。结果 经系统发育分析,有7个种共66株柠檬酸杆菌。优化条件为哥伦比亚血平板做培养基、转种1次、培养24 h,甲酸溶液体积25 μl。新增沃克曼氏柠檬酸杆菌与C.pasteurii2个菌种谱图,补充中国株弗氏、布氏、吉氏、杨氏、无丙二酸柠檬酸杆菌等5个菌种本地区谱图；结论 leuS基因可以有效区分柠檬酸杆菌属菌种,MALDI-TOF 图谱库的扩展提升了质谱对本地区柠檬酸杆菌属菌种鉴定准确性。     

聚合酶链式反应和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定克罗诺杆菌

目的 采用聚合酶链式反应(PCR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术快速鉴定克罗诺杆菌的方法,实现对该菌显色培养基上生长的可疑菌落高通量、低成本初筛。方法 通过内转录间隔区(its)基因设计针对克罗诺杆菌的属特异性引物,以7株参考菌株为对照,对2013年国家食品安全污染物监测网上报、初步鉴定为克罗诺杆菌的214株菌株进行复核鉴定。同时随机挑选其中84株菌,采用MALDI-TOF-MS技术和VITEK革兰阴性细菌鉴定卡鉴定。结果 7株参考菌株的PCR结果与对应大小一致,214株待测菌株PCR结果均为阳性。84株菌MALDI-TOF-MS和VITEK鉴定的结果均为克罗诺杆菌,符合率为100%。结论 PCR和MALDI-TOF-MS技术具有高通量、低成本、耗时短等优势,可以实现大量可疑菌落的初筛,为我国克罗诺杆菌的监测和防控提供技术支持。     

Matrix-assisted laser desorption and ionization-time-of-flight mass spectrometry, 16S rRNA gene sequencing, and API 32E for identification of Cronobacter spp.: a comparative study

Twenty-two isolates of the family Enterobacteriaceae, with focus on Cronobacter isolated from infant formula and the environment of milk powder plants, were comparatively identified using API 32E (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France), 16S rRNA gene sequencing (Accugenix, Newark, USA), and matrix-assisted laser desorption and ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS; Mabritec, Riehen, Switzerland and AnagnosTec, Potsdam, Germany). With API 32E, 22% of the isolates were assigned to species, 64% were assigned to a genus, and 14% could not be discriminated at any taxonomic level. Both 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS assigned 100% of the isolates to species, but the identifications based on MALDI-TOF MS results were more discriminating and unequivocal. Our data indicate that MALDI-TOF MS provides the most rapid and unambiguous identification of Cronobacter and closely related Enterobacteriaceae isolates.     

Bovine mastitis bacteria resolved by MALDI-TOF mass spectrometry

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a fast and reliable method to identify the most common pathogenic bacteria in humans and animals. The goals of this study were to amend a commercial database with additional species, evaluate the amended database for identification of bacterial genera and species causing bovine mastitis, and describe the plethora of species involved. In total, 500 udder pathogenic isolates were subjected to MALDI-TOF MS using bacterial or fungal colony material; 93.5% could be identified to the species level, and 6.5% were identified only to the genus level. Isolates identified to the genus level required further identification to the species level by conventional methods or 16S rDNA sequencing. Mass spectra from verified species were used to expand the MALDI-TOF MS database to improve future identification ability. A total of 24 genera and 61 species were identified in this study. Identified isolates were mainly staphylococci, streptococci, Enterobacteriaceae, and coryneforme bacteria. In conclusion, MALDI-TOF MS is a powerful, rapid, and reliable technique to identify the most common microorganisms causing bovine mastitis, and the database can be continuously expanded and improved with additional species.     

16S rRNA基因序列、生化鉴定、质谱3类方法鉴定常见微生物的结果分析

目的比较16SrRNA基因序列、生化鉴定、质谱鉴定3类实验方法分析沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的鉴定结果的异同。方法挑选沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌各50株,分别进行16S rRNA基因序列测定、VITEK COMPACT 2生化鉴定、质谱鉴定3类实验,并比较3类实验的鉴定结果。结果 3类实验方法对大部分沙门氏菌鉴定在属水平,生化鉴定方法对少数血清型鉴定到种水平;对金黄色葡萄球菌均鉴定到种水平; 16SrRNA基因序列、生化方法对蜡样芽孢杆菌鉴定到属水平,质谱鉴定到种水平。结论 3类实验方法对大部分沙门氏菌、所有金黄色葡萄球菌鉴定水平相同,质谱鉴定蜡样芽孢杆菌的结果更准确,且质谱鉴定时效性更高。     

克罗诺杆菌的随机多态性扩增DNA(RAPD)基因分型研究

研究了克罗诺杆菌标准菌株和样品中分离菌株的分子特征,为克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源提供一种有效手段。采用随机引物扩增多态性DNA分析对38株菌株进行基因分型。筛选出1条随机引物,每一菌株可扩增出1～7条DNA片段,片段在400-3500bp,可将8株标准菌株的种间区分开来。以相似性50%为标准,38株克罗诺杆菌按照其遗传差异可以分为8个基因型类群。所建立的RAPD技术可用于克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源研究。     

基于MALDI-TOF MS技术对李斯特氏菌属两种细菌的快速鉴定

为提高基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)在李斯特氏菌属鉴定中的分辨能力,建立快速准确鉴定单增和英诺克李斯特氏菌的质谱学方法。通过采集79株单增和57株英诺克李斯特氏菌的指纹图谱,利用Clin Pro tools软件对数据进行统计学分析,建立数学判别模型并验证其准确性。峰统计结果显示,两组数据峰强度差异显著的特征峰有16个,推测出单增李斯特氏菌生物标志物6个,英诺克李斯特氏菌10个,发现在单增李斯特氏菌中质量峰3985/7970 u和3972/7942 u是独立且连锁存在。基于遗传算法的判别模型交叉验证率和检测识别能力最强,分别为99.44%和100.00%,经验证准确率达到96%以上,可实现对单增和英诺克李斯特氏菌的快速准确鉴定。同时,利用Bruker Biotyper软件将以上菌株建库形成了实验室内部李斯特氏菌谱库,对8株未测李斯特氏菌进行搜库鉴定,匹配分数均高于商品化数据库,提升了MALDI-TOF MS对李斯特菌属的自动鉴定能力。