葡萄糖发酵生产ε-聚赖氨酸工艺优化

为建立Streptomyces albulus M-Z18以葡萄糖为碳源的ε-聚赖氨酸(ε-PL)高效发酵工艺,对葡萄糖和硫酸铵的流加方式和控制浓度、pH控制条件和溶氧控制水平进行了系统研究。研究结果表明,葡萄糖补料采用脉冲补料方式控制维持在10~30 g/L范围,氨氮补料采用脉冲补料方式维持在0.1~0.5 g/L范围,pH冲击时间为9 h、恢复pH为3.85,发酵中后期最佳溶氧水平为20%左右为最优ε-PL发酵工艺控制条件。经过8天补料-分批发酵,实现ε-PL产量达到47.13 g/L,菌体量为57.08 g/L,相比于优化前,ε-PL产量和菌体量分别提高了27.34%和19.61%。上述研究结果为ε-PL工业化生产奠定了基础。     

发酵过程流加L-谷氨酸提高ε-聚赖氨酸的产量

为了提高Streptomyces sp.M-Z18合成ε-聚赖氨酸(ε-PL)能力,在考察L-谷氨酸添加浓度和添加时机基础上,提出发酵过程中流加L-谷氨酸的策略。结合甘油补料-分批发酵方式,该策略实现174 h内ε-PL发酵产量和产率分别达到31.65 g/L和4.36 g/(L·d),较原发酵工艺分别提高49.2%和43.9%。实验结果表明,发酵过程流加L-谷氨酸是提高ε-PL发酵水平的有效策略之一。     

优化有机氮源提高小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸效率

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是小白链霉菌(Streptomyces albulus)分泌产生的一种同型氨基酸聚合物,具有广泛的抑菌活性,目前被多个国家批准使用,是一种优良天然食品防腐剂。为了进一步提高S. albulus GS114的ε-PL发酵产量,对其发酵培养基中有机氮源的种类及浓度进行了系统优化,并对ε-PL产量提高的原因从氨基酸方面进行了初步解析。研究结果显示,S. albulus GS114的最佳有机氮源为酵母浸粉FM760,最佳添加质量浓度为9.27 g/L,在此条件下,摇瓶自然发酵中ε-PL产量达到(2.60±0.02) g/L,较对照有机氮源提高了22.07%;在pH受控的分批发酵中,ε-PL产量达到(6.41±0.23) g/L,较对照提高42.64%;在补料分批发酵中,ε-PL产量达到62.38 g/L,较对照提高了18.80%,葡萄糖转化率提高了25.77%。同时,通过氨基酸添加实验,初步发现酵母浸粉FM760提高ε-PL产量可能与异亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸有关。该研究结果对工业发酵生产ε-PL的有机氮源选择具有重要指导意义。     

50L自控式发酵罐中ε-聚赖氨酸发酵条件的优化

在50L自控式发酵罐上进行了ε-聚赖氨酸(ε-PL)发酵条件的优化研究,主要考察了分批发酵和补料分批发酵过程中pH、搅拌转速对ε-PL发酵和菌体生长的影响。结果表明,当控制pH在5.0以上时有利于菌体的生长,但ε-PL基本不合成,甚至出现降解现象;当维持pH在4.0左右时,能促进ε-PL的合成。搅拌转速为300 r/min时,有利于溶氧和传质,400r/min时,由于剪切力过大,导致菌丝断裂,ε-PL产量下降。通过控制发酵中后期pH4.0和搅拌转速300r/min的pH反馈控制自动流加补料培养,可获得最大的ε-PL产量7.36g/L,产率0.072g/g,产量较优化前提高近10倍,产率提高2倍。     

碳源和氮源流加方式对ε-聚赖氨酸补料-分批发酵过程的影响

为实现Streptomyces sp.M-Z18补料-分批发酵甘油生产ε-聚赖氨酸(ε-PL)的自动流加碳源和解决因发酵中后期菌体生长速率下降/停滞引起ε-PL合成速率下降的问题,该文首先借助DO-stat反馈补料方法,考察了补料阶段甘油控制在不同浓度范围内对ε-PL合成的影响;然后,通过在发酵中期分别流加牛肉膏和酵母粉,研究了2种有机氮源对发酵中后期菌体生长和ε-PL合成的影响;最后,在2阶段pH调控策略基础上,评价了上述最优控制条件下对Streptomyces sp.M-Z18合成ε-PL的促进作用。实验结果表明,依靠DO-stat反馈补料方式将补料阶段甘油浓度稳定控制在0¹0 g/L,并在发酵96 h开始流加酵母粉和(NH4)2SO4混合液,结合pH值2阶段调控策略(3.5→3.8),经过192 h发酵,可以实现ε-PL产量达到38.77 g/L,产率达到4.85 g/(L·d)。基于碳源和氮源流加方式的优化,建立的DO-stat反馈流加甘油策略和提出的发酵中期流加酵母粉和(NH4)2SO4混合液的方法是提高ε-PL发酵水平的有效方法之一。     

50L自控式发酵罐中ε-聚赖氨酸发酵条件的优化

在50L自控式发酵罐上进行ε-聚赖氨酸发酵条件优化研究,主要考察了分批发酵和补料分批发酵过程中pH、搅拌转速对ε-PL发酵和菌体生长的影响。结果表明,当控制pH在5.0以上时有利于菌体的生长,但ε-聚赖氨酸基本不合成,甚至出现降解现象;当pH维持在4.0左右时,能促进ε-聚赖氨酸的合成。搅拌转速为300r/min时,有利于溶氧和传质,400r/min时,由于剪切力过大,导致菌丝断裂,ε-PL产量下降。通过控制发酵中后期pH4.0和搅拌转速300r/min的pH反馈控制自动流加补料培养,可获得最大的ε-PL产量7.36g/L,产率0.072g/g,产量较优化前提高近10倍,产率提高2倍。     

中间代谢产物对白色链霉菌ε-聚赖氨酸合成的影响

探讨白色链霉菌ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)生物合成过程中,中间代谢产物柠檬酸、L-天冬氨酸和L-赖氨酸对ε-PL合成的影响。单因素实验结果表明,在摇瓶发酵开始(0 h)添加柠檬酸至终质量浓度为1.0g/L,培养到12 h分别添加终质量浓度为0.3 g/L的L-天冬氨酸和终质量浓度为1.0 g/L的L-赖氨酸,可分别提高ε-PL产量42.5%、28.7%和44.1%。正交试验显示,只有柠檬酸和L-赖氨酸对ε-PL合成影响显著(P0.05),而L-天冬氨酸影响不显著;在培养基中添加1.0 g/L的柠檬酸和L-赖氨酸ε-PL产量可提高60.1%。在破碎的无细胞体系中,只有添加L-赖氨酸可以检测到ε-PL的生成,进一步证实了L-赖氨酸是ε-PL合成的直接前体。因此,通过添加合适的中间代谢产物,可以有效提高ε-PL产量。     

添加ATP和生物素优化ε-聚赖氨酸发酵的研究

以白色链霉菌（Streptomyces albulus）突变株为研究对象,研究不同发酵时间在发酵培养基中添加ATP、生物素对ε-聚赖氨酸产量的影响。结果表明,在发酵36h时添加2mmol/L的ATP的产量比对照组提高了21.88%,达到1.17g/L;在0h、36h添加400μg/L生物素的ε-PL产量分别比对照组提升了30.88%和18.52%;通过进一步正交试验发现,在36h时添加300μg//L的生物素以及2mmol/L的ATP对该白色链霉菌ε-PL产量提升最大,比对照组提高了34.04%,产量达到1.193g/L,说明外源添加ATP和生物素对白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸有促进作用。     

柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌发酵产ε-聚赖氨酸的影响

本文研究了不同生长期在培养基中添加柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌生长及产ε-PL的影响,结果表明添加不同浓度柠檬酸钠对菌体生长的影响不明显,但对白色链霉菌ε-PL合成有正向促进作用。0 h添加2 g/L的柠檬酸钠可获得最大的ε-PL产量0.92g/L。随着柠檬酸钠浓度的增加,ε-PL产量先增加后降低。在0 h添加2 g/L柠檬酸钠并在36 h添加300μg/L生物素,发酵72 h后菌体干重和ε-PL产量分别达到了7.86 g/L和1.10 g/L,是空白对照组的1.30倍和1.93倍,说明外源添加柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌发酵生产ε-PL有促进作用。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量

为提高灰褐链霉菌（Streptomyces griseofuscus LS-6）的ε-聚赖氨酸（ε-poly-lysine,ε-PL）发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌（Brebvibacterium flavum S62）进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1 株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73 倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力（己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等）和胞内氨基酸含量（赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等）均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

外源添加维生素C对链霉菌ε-聚赖氨酸发酵的影响

采用荧光染色分析ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)产生菌Streptomyces sp. AF3-44在摇瓶发酵过程中胞内活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平与菌体活力,比较添加Vc对ε-PL产量、抗氧化酶类活性、总抗氧化能力、细胞膜脂成分及细胞氧化损伤的影响,并在5 L发酵罐上对比了添加Vc后分批发酵过程参数的变化。在摇瓶发酵过程中,随着p H值降低和ε-PL浓度的上升,Streptomyces sp. AF3-44胞内ROS累积,菌体活力下降;而Vc的添加提高了细胞的总抗氧化能力及膜脂中不饱和脂肪酸所占比例,减少了氧化损伤;在5 L发酵罐中添加Vc,分批发酵44 h,ε-PL产量为7. 73 g/L,为不添加Vc发酵的1. 5倍。通过外源添加抗氧化剂,增强菌体抗氧化能力,减少氧化损伤,为提升链霉菌ε-PL的发酵水平提供了一种新的策略。     

pH-DO组合调控策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸的生物合成

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是一种主要由小白链霉菌生产的广谱性天然食品防腐剂，具有广泛的工业应用价值。该研究对ε-PL高产菌Streptomyces albulus WG-608在5 L罐发酵不同阶段的pH与溶解氧(dissolved oxygen, DO)进行了系统优化，并构建了一种新的pH-DO组合调控策略。该策略将发酵分为2个阶段：第一阶段DO被控制在40%,pH维持在4.0;第二阶段DO被控制在20%,pH维持在4.3。经240 h的补料-分批发酵，WG-608的ε-PL产量与平均比生产速率为(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d^-1,比对照策略分别提高了28.23%和12.02%。为进一步探究该策略提高WG-608 ε-PL产量的细胞生理代谢差异的原因，对不同时期细胞的关键酶活力、呼吸链活力和辅因子水平等进行了分析。结果表明，葡萄糖消耗、中心碳代谢途径、L-赖氨酸生物合成途径、呼吸链活性和胞内辅因子的增强是pH-DO组合调控策略增强ε-PL产量的原因。总之，pH-DO组合调控策略是一种通过增强碳代谢和能...     

产ε-聚赖氨酸菌补料分批发酵工艺的研究

探讨了白色链霉菌产ε-聚赖氨酸补料分批发酵工艺中,p H调控方式、碳源、氮源、转速调控方式对ε-聚赖氨酸菌体生长和产物合成的影响。结果表明:通过在发酵中后期控制搅拌转速400r/min,葡萄糖初始浓度为50g/L,氨水流加控制p H为4,流加补料培养基中硫酸铵浓度控制为6%的工艺条件下,可获得ε-聚赖氨酸产量20.6g/L,生物量24.4g/L,分别比优化前提高了155%和37.2%。     

碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响

以γ-聚谷氨酸生产菌yt102为供试菌株,研究了碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响.首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳碳源为葡萄糖和柠檬酸,二者按一定的比例混合更有利于聚谷氨酸的产生,进一步利用10L发酵罐补料分批发酵确定碳源的最佳用量为40g/L,继续优化培养条件,确定采用溶氧控制的脉冲补料方式可有效延续γ-聚谷氨酸的合成.在最优发酵条件下,通过10L发酵罐补料分批发酵50h,r-聚谷氨酸产量可达34.5g/L.     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量（英文）

为提高灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus LS-6)的ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine,ε-PL)发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum S62)进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力(己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等)和胞内氨基酸含量(赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等)均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

发酵生产γ-聚谷氨酸的补料策略

采用补料分批发酵方法对Bacillus subtilis GXA-28摇瓶发酵生产γ-聚谷氨酸的初始葡萄糖和谷氨酸钠浓度、补料时间、补料配方等进行了研究。确定最优补料时间为17 h,补料配方:葡萄糖20 g/L,谷氨酸5 g/L,KH2PO40.5 g/L、MgSO40.1 g/L。在优化的补料条件下,γ-聚谷氨酸产量由16.24 g/L提高至24.36 g/L,较分批发酵提高了50%;生产强度由0.74g/(L·h)提高至0.87 g/(L·h)。研究结果表明,采用分批补料发酵方法能提高γ-聚谷氨酸生产率,实验方法可给γ-聚谷氨酸中试研究提供参考。     

Paenibacillus polymyxaZJ-9混合发酵菊粉和葡萄糖合成R,R-2,3-丁二醇

在7.5 L发酵罐上考察了Paenibacillus polymyxa ZJ-9混合发酵菊粉和葡萄糖合成R,R-2,3-丁二醇的工艺条件。选用菊芋菊粉粗提液为发酵前期底物,分析比较不同初始菊粉浓度下的细胞比生长速率(μ)和产物比合成速率(qp),进而研究了补糖种类和不同补料方式对合成R,R-2,3-丁二醇的影响。结果表明,初始菊粉75.0g/L,当发酵到24 h、31 h时,分别添加15.0 g/L的葡萄糖,发酵效果最佳,44 h时,产物产量达到最高值47.8 g/L,与分批发酵相比,糖转化率由原来的34.9%提高到45.5%,生产强度由原来的0.70 g/(L·h)提高到1.09 g/(L·h),并且副产物乙偶姻、残糖浓度相对较低。     

Bacillus mucilaginosus SM-01补料分批发酵产胞外多糖

在5 L发酵罐上对Bacillus mucilaginosus SM-01发酵产胞外多糖的发酵工艺进行研究。通过分析分批发酵时不同初始葡萄糖浓度对菌体生长及多糖合成的影响,选取60 g/L为最适初始葡萄糖浓度。进一步研究初始葡萄糖浓度为30 g/L时不同补料方式对产糖的影响,结果表明分批补料为最适补料方式。采用分批补糖发酵工艺,即初始葡萄糖浓度为30 g/L,发酵后期分批次补加剩余30 g/L葡萄糖,胶质芽孢杆菌胞外多糖的浓度可达到38.62 g/L,较分批发酵提高36.8%,葡萄糖转化率由47.0%提高至64.4%。     

L-色氨酸营养缺陷型高产菌株的发酵工艺研究

目的以L-色氨酸营养缺陷型高产菌HX22-118为出发菌株,研究探讨L-色氨酸补料分批发酵工艺。方法通过对L-色氨酸补料分批发酵工艺中不同初糖浓度、不同补料方式、碳氮源比例、不同p H值调节方式、添加L-苯丙氨酸、L-酪氨酸对发酵的影响进行了研究。结果通过补料分批发酵工艺能有效地解除了高糖对菌体生长的抑制,促进菌体生长产酸,选择初糖淀粉浓度为90 g/L,保持葡萄糖总浓度160 g/L,在发酵第24 h开始连续流加剩余的糖,并于发酵第12 h和24 h分2次补加各50 mg/L的L-苯丙氨酸、L-酪氨酸,同时用氨水与Na OH控制发酵过程的p H,发酵产酸较分批发酵的33.5 g/L提高49.5%,达到50.1 g/L,缩短了发酵周期,提高了原料利用率。结论形成一套先进的L-色氨酸工业化发酵生产工艺技术,产酸高,生产运行稳定。     

白色链霉菌发酵ε-Polylysine动力学研究

利用白色链霉菌(Streptomyces Albus KD-11)为出发菌株在30L全自动发酵罐中进行ε-PL分批发酵动力学研究。基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程、类似Luedeking-Piret方程建立了Streptomyces Albus KD-11菌体生长、ε-PL产物合成和底物葡萄糖消耗的动力学模型。利用Origin 8.1软件对模型参数进行非线性拟合,建立的模型拟合程度R2均大于0.980,拟合良好。当葡萄糖初始浓度在45~55g/L范围内,实验数据与模型预测值平均相对误差小于8%,适用性良好。表明该动力学模型对指导ε-PL的发酵工艺优化具有指导意义。