烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。     

根癌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白融合基因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200μmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。     

马铃薯块茎启动子驱动的淀粉合成酶基因RNAi载体构建及遗传转化

以马铃薯gbss、ssⅢ与ssⅡ基因的部分c DNA片段拼接成的融合基因gbs_3s_2为靶标,构建以马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS驱动的RNAi表达载体p ART-GF。采用农杆菌介导法对NHD3、NF和NC三个马铃薯品种进行了遗传转化,用PCR技术检测转基因植株,采用双波长法测定其微型薯中直链淀粉与支链淀粉的比值。经抗性筛选及PCR检测初步获得10株阳性植株,其中NC、NF和NHD3分别为2株、3株和5株,其微型薯中直链淀粉/支链淀粉比值明显下降。作者成功构建了马铃薯块茎启动子GBSS驱动的淀粉合成酶基因RNAi三价表达载体,初步获得了转基因马铃薯育种材料。     

hrpZpsta和RIPs双价抗病基因转化大豆的研究

构建了含有hrpZpsta和RIPs的双价抗病基因植物表达载体,采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为外植体,将双价抗病基因hrpZpsta和剧风转人大豆品种吉农28中,以耐盐基因BADH作为筛选标记基因、筛选得到T1阳性植株18株;T1。转基因植株PCR、Southern杂交及RT—PCR检测表明外源基因已成功整合到了大豆基因组中并可遗传给后代。     

多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化加工番茄

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导将多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因导入新疆加工番茄(代号:99-162混)。卡那霉素抗性筛选,获得移栽成活的10株再生植株,PCR和Southern blot检测表明,其中4株再生植株的染色体中有外源基因的插入。所得4株转基因加工番茄在基因转化处理当代表现不同;果实饱满有光泽;Northern杂交结果表明,转反义PG基因加工番茄果实外果皮PG基因表达水平比对照低。转基因植株的表型观察和分子检测结果相吻合。     

小黑杨转双价抗虫基因的研究

用根癌农杆菌介导的叶盘法,将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(Populussimonii×P.nigra),所获得的3株卡那霉素抗性再生植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测的结果均为阳性,Southern杂交检测的结果2株为阳性.抗虫试验结果显示,3个转基因株系均具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用.     

农杆菌介导microRNA398靶基因转化大豆

拟南芥miR398对低磷胁迫有响应。通过生物信息学方法预测找到大豆miR398a的靶基因铜/锌超氧化物歧化酶GmSODC（Copper/zinc superoxide dismutase）,通过RT-PCR扩增得到该酶的全长cDNA,采用LIC（Ligation-Independent cloning）法将GmSODC连接到双元植物表达载体pJG045上,构建成植物表达载体pSDC6。通过农杆菌介导的子叶节法将GmSODC基因导入大豆品种东农50中,获得了转化GmSODC的T1植株。采用Real-time PCR方法,对转基因植株进行GmSODC基因转录水平的相对定量分析,其中1株较非转基因植株表达量明显提高。     

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植物

GFP作为报告分子被广泛地运用在转基因植株检测中.利用PCR技术扩增得到番茄Bax inhibitor-1基因(LeBI-1),亚克隆到含GFP基因的pEGFP载体上,进一步将中间载体构建到植物表达载体pBI121上.重组pBI121-LeBI-1-EGFP经农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,分化筛选后获得抗性烟草植株.利用GFP作为报告基因,采用PCR、southern blot及荧光方法验证外源基因LeBI-1成功转化到烟草中.分析讨论报告蛋白GFP不同检测方法的优缺点.     

HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。      

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化

以日本腈为材料,研究根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化。研究结果表明,通过农杆菌介导的方法将水稻香味基因badh2导入了水稻粳稻品种日本腈中,并获得转基因植株。通过PCR检测,初步证明外源基因badh2已整合到日本腈基因组中。     

油菜BnROP1同源基因沉默导致拟南芥雄性不育

基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了一个油菜差异表达基因,其对应的拟南芥同源基因为At3G51300（AtROP1）,采用荧光定量PCR方法,对油菜中该基因（BnROP1）在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行了分析,在此基础上构建了AtROP1基因的microRNA干扰载体,通过农杆菌介导的拟南芥转化,获得12株转基因苗。T1转基因植株大多出现角果数量减少或不结实、无花粉、花药萎缩以及小孢子数量大大减少的表型。对转基因T2多个株系的荧光定量PCR分析说明,目标基因的干扰是有效的,靶基因的表达水平都显著下调。说明转基因植株的雄性不育表型和ROP1基因的表达沉默有关,ROP1基因不仅控制了花粉管的极性和伸长,还和小孢子的正常发育密切相关。     

利用冷诱导表达ICE1载体提高烟草抗寒性

利用拟南芥克隆转录激活因子ICE1和RD29A启动子,将ICE1连上RD29A启动子,构建成冷诱导植物表达载体pBin-RD29ICE1,通过农杆菌介导法转化烟草,获得了99棵抗性转基因再生烟草植株。通过PCR鉴定44%为阳性,将PCR检测到的44棵阳性植株进行Southern杂交检测,80%为阳性。转基因与野生型烟草同时经受低温处理,前者抗寒性明显提高。     

转RIPs基因甜菜的分子检测和抗病性鉴定

对利用农杆茵介导法转化的经卡那霉素筛选的转核糖体失活蛋白(RIPs)基因甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,并对分子检测呈阳性的转基因甜菜植株接种甜菜褐斑病菌,接种20d后,发现75%植株具有抗病性.     

烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成

为明确烟草烟碱去甲基酶基因CYP82E4v1在降烟碱生物合成中的调控作用,通过农杆菌介导,将含CYP82E4v1超量表达的植物表达载体pLF-35S-CYP和干涉表达的植物表达载体pLF-35S-CYPi分别遗传转化烟草品种K326,共获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。HPLC测定表明,超量表达植株降烟碱含量比对照烟草品种K326高88.9%,而干涉表达植株降烟碱含量比对照烟草低61.1%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因的表达为对照烟草的20倍以上,在干涉表达植株中其表达量仅为对照烟草的6%。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的"Gene-deletor"表达元件,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源GUS∷NPT II基因,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。     

RNAi沉默淀粉分支酶sbe3基因对水稻直链淀粉的影响

本研究利用RNAi技术,通过RT-PCR方法克隆出水稻淀粉分支酶sbe3基因片断,经两步组装法将sbe3基因片断分别正向、反向组装入pRNAi-ubi,成功构建sbe3基因RNAi转化载体pRNAi-ubi/sbe3。在农杆菌介导下,对粳稻中花11未成熟胚诱导的愈伤组织进行转化,通过PCR、Southern杂交鉴定获得一批转基因植株。半定量RT-PCR鉴定出转化苗T1代种子中sbe3基因表达被明显抑制,但只引起转基因水稻胚乳中直链淀粉含量少量的提高,说明采用RNAi仅沉默sbe3基因对水稻胚乳直链淀粉含量没有显著影响。     

甜菜转基因植株抗性表现及种子获得

用农杆菌介导方法，将甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白（BNYVV CP）基因转化甜菜不同品系叶柄外植体。以卡那霉素作为筛选标记基因，获得抗卡那霉素再生植株。再生植株经PCR扩增，获得目的基因大小的DNA片段，初步证明为转基因植株。部分转基因TO代植株在病土中实验表明，其抗病性明显高于对照。将移栽田间所获得的转基因甜菜母根进行单株套罩采种，获得不同品系单株自交种。     

转OjDREB基因提高烟草耐盐能力的研究

利用农杆菌介导法将沿阶草OjDREB基因转入烟草植株中.通过RT-PCR检测,获得转OjDREB基因的烟草植株.以400 mmol/L NaC1处理转基因烟草植株和野生型对照10 d后,结果显示:转基因烟草体内叶绿素含量和SOD酶活性是野生型对照的16.98倍和1.91倍;体内的MDA含量和电解质渗透率分别是野生型对照的59.23％和55.07％,说明过量表达OjDREB基因可以提高烟草的耐盐能力.     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA（amiRNA）干扰载体（该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因）转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强（P〈0.05）。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。