半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库

目的：构建天然噬菌体单域重链抗体文库,淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法：以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,提取RNA 反转录为cDNA,根据重链抗体保守序列设计引物,通过半巢式PCR 法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1 得到初级抗体库,辅助噬菌体KM13 感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3 种人工抗原进行淘选。结果：单域重链抗体编码基因得到有效扩增,经10 次电转化获得初级文库,命名为SNAL,实际库容量达到1.6 × 107 个独立克隆,菌落PCR 鉴定结果表明,克隆效率约为87%,辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SNA-PDL,滴度达1013CFU/mL。对3 种不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA 和AFB1-OVA 的淘选均有富集现象。结论：构建了天然噬菌体单域重链抗体文库,文库的多样性较好,可以用于后续淘选。     

抗黄曲霉毒素单链抗体基因的克隆与表达

为降低黄曲霉毒素抗体制备成本,在已有的能分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞系8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链（VH）和轻链可变区（VL）基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽（Linker）编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体（ScFv）基因,并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB 5E上,使单链抗体以噬菌体展示形式在大肠杆菌TG1中表达。间接竞争ELISA方法检测到该ScFv对黄曲霉毒素B1的抑制率（IC50）值为0.57ng/mL,表明该单链抗体与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性,且具有很高灵敏度。     

噬菌体展示肽库技术及其在农药残留免疫 分析中的研究进展

噬菌体展示技术是一种特殊的基因工程重组表达技术, 已经作为一种强大的工具运用在不同的研究中, 包括筛选抗体和酶的配体、筛选小分子的受体、基因工程抗体等。免疫分析作为农药残留快速筛查技术被广泛研究, 利用抗体从噬菌体展示肽库中淘选竞争物, 可以加快异源免疫分析方法的建立; 利用抗原抗体复合物从噬菌体展示肽库中淘选抗免疫复合体多肽, 可建立非竞争免疫分析方法, 丰富农药的免疫分析模式。本文从噬菌体展示技术的原理、噬菌体展示肽库的构建和噬菌体展示肽库的筛选方面概述了噬菌体展示肽库技术; 从模拟表位筛选、抗免疫复合体筛选和新免疫分析方法方面阐述了噬菌体展示肽库技术在农药等小分子免疫分析中的应用; 并对噬菌体展示肽库技术的研究和应用前景进行了展望。     

噬菌体展示肽库技术及其在农药残留免疫分析中的研究进展

噬菌体展示技术是一种特殊的基因工程重组表达技术,已经作为一种强大的工具运用在不同的研究中,包括筛选抗体和酶的配体、筛选小分子的受体、基因工程抗体等。免疫分析作为农药残留快速筛查技术被广泛研究,利用抗体从噬菌体展示肽库中淘选竞争物,可以加快异源免疫分析方法的建立;利用抗原抗体复合物从噬菌体展示肽库中淘选抗免疫复合体多肽,可建立非竞争免疫分析方法,丰富农药的免疫分析模式。本文从噬菌体展示技术的原理、噬菌体展示肽库的构建和噬菌体展示肽库的筛选方面概述了噬菌体展示肽库技术;从模拟表位筛选、抗免疫复合体筛选和新免疫分析方法方面阐述了噬菌体展示肽库技术在农药等小分子免疫分析中的应用;并对噬菌体展示肽库技术的研究和应用前景进行了展望。     

氧氟沙星单链抗体库的构建、筛选及蛋白结构模拟

利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,通过PCR扩增获得VH和VL可变区基因,采用重叠延伸PCR技术将VH和VL拼接为全长scFv基因片段,将经内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的scFv基因片段插入到T7噬菌体中,经包装蛋白体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL氧氟沙星单链抗体库,经过4轮吸附-洗脱-扩增的富集后,采用直接竞争ELISA筛选得到4个特异性噬菌体scFv,经测序最后运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构和物理化学性质。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了坚实的基础。     

西维因抗体库的构建及特异性克隆的筛选

在计算机辅助下,设计并合成西维因半抗原,与载体蛋白KLH连接后免疫Balb/C小鼠,经过5次免疫后,最高效价和特异性抑制率分别达到254 000和26%;提取免疫后小鼠脾脏总RNA,纯化mRNA后反转录获得cDNA,利用设计的兼并引物获得长度约为400 bp的轻链可变区和重链可变区基因片段,重叠延伸后获得长度约为780 bp的单链抗体基因。经过EcoR I和HindⅢ酶切后,连入T7噬菌体臂,构建西维因特异性的抗体库,抗体库原始滴度为1.74×107pfu。以西维因-OVA为配体对抗体库进行淘选,经过4轮淘选后,利用直接ELISA对获得噬菌体克隆进行特异性检测,西维因对克隆A4-7和A4-16的抑制率分别达到54.1%和66.4%。经过序列测定,2个克隆的轻链可变区分别由108和112个氨基酸构成,重链可变区分别由117和112个氨基酸构成。     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

抗AFB_1单域重链抗体文库淘选方法的研究

比较两种从噬菌体展示文库中淘选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的方法,并为淘选针对小分子物质的单域重链抗体提供参考.采用固相淘选技术,以黄曲霉毒素B1人工抗原为靶分子,淘选天然单域重链抗体库,分别采用Gly-HCl法和AFB1竞争法洗脱结合噬菌体,对洗脱物进行滴度测定,以回收率和富集度为指标,对两种洗脱方法进行比较.采用phage-ELISA法鉴定噬菌体克隆,并对阳性克隆进行交叉反应分析以及序列测定.滴度测定结果显示,Gly-HCl法回收率比竞争法高5～10倍.分别随机挑取20个单克隆进行phage-ELISA鉴定,其中,Gly-HCl洗脱法未获得阳性克隆,AFB1竞争洗脱法得到8个阳性克隆.序列测定结果显示,这8个克隆均编码单域重链抗体.     

噬菌体随机肽库淘选桔霉素模拟表位的研究

目的:从噬菌体随机肽库中淘选模拟桔霉素表位的噬菌体粒子。方法:以抗桔霉素的单克隆抗体为配基,分别免疫亲和淘选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机7肽库和12肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序以分析插入的7肽和12肽的氨基酸序列。结果:经过3轮淘选,在7肽库中淘选到20株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,在12肽库中淘选到33株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合均能被桔霉素阻断,模拟表位的共有序列为X-组氨酸-赖氨酸-X-X-X-X,X为任意氨基酸。以7肽库中亲和力最强的克隆(P10)建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为10～325ng/ml,检测下限为10ng/ml;以12肽库中亲和力最强的克隆(P1)建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为10～439ng/ml,检测下限为10ng/ml。结论:噬菌体展示技术可成功淘选到桔霉素模拟表位,高度保守的His和Lys的存在,提示His和Lys在CIT与其配体的结合中可能起重要作用。     

利用噬菌体肽库淘选玉米赤霉烯酮的模拟表位

目的:利用噬菌体肽库淘选玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)模拟表位。方法:以抗ZEN单克隆抗体为配体,利用噬菌体七肽库淘选ZEN的模拟表位,采用了逐轮减少抗体包被浓度,交换使用封阻液中蛋白质种类的方法,经三轮淘选后,随机挑取20个克隆测序并以ELISA方法及竞争ELISA实验,以确定阳性克隆。结果:获得10种序列,ELISA显示其中两种序列为阳性克隆,抑制率达90%以上,其氨基酸序列分别为DAVILLM,HHCHWWH。结论:噬菌体展示技术可淘选到ZEN的模拟表位,淘选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学检测方法。     

基于ELISA克罗诺杆菌单链抗体制备与鉴定

利用基因工程技术制备克罗诺杆菌特异性单链抗体(sc Fv)。从克罗诺杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,利用RT-PCR反转录合成第一链c DNA后再扩增出抗体的重链可变区(VH)和轻链变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR的方法,用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)3将VH基因和VL基因拼接成sc Fv基因片段,XhoⅠ﹑Eco RⅠ限制性内切酶双酶切sc Fv后克隆到原核表达载体p ET-26b中构建重组质粒sc Fv-pet-26b,挑取阳性克隆提取重组质粒后转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,通过His柱进行亲和层析,最后利用ELISA检测单链抗体的活性。成功构建了表达克罗诺杆菌单链抗体的基因工程菌株,通过SDS-PAGE和ELISA试验结果表明,诱导表达的罗诺杆菌单链抗体分子量约为30 k Da,其能与罗诺杆菌特异性结合,可作为免疫检测罗诺杆菌的候选抗体分子。     

食源性诺如病毒单克隆抗体可变区基因克隆及结构特征分析

食源性诺如病毒是引发全球食品安全事件的重要病原,近年来新冠疫情的持续肆虐,更突显了加强食品领域病毒安全研究的紧迫性。该研究以实验室前期获得的食源性诺如病毒高效单克隆抗体为对象,克隆并系统分析了其重链和轻链可变区基因序列。从分泌食源性诺如病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3中提取总RNA,通过RT-PCR扩增单克隆抗体1E3的重链可变区VH和轻链可变区VL的DNA序列。将产物克隆到PMD19-T载体,测序并分析其可变区氨基酸序列。通过NCBIblast比对,显示扩增的VH和VL序列为小鼠抗体可变区序列,进一步利用Vbase2数据库对测序结果进行基因结构分析,定位了VH和VL上的高变区域互补决定区CDR和骨架区域FR,各包含3个CDR和4个FR区域,其中VH片段为360bp,编码120个氨基酸,属于IGHV3-2*02家族;VL片段为339bp,编码113个氨基酸,属于IGKV1-135*01家族。通过分子对接表明抗体重链上位点D108与病毒衣壳P蛋白上N195形成氢键,为关键氨基酸残基。食源性诺如病毒单克隆抗体VH和VL片段的成功扩增促进了基因工程抗体的发展及其在食品安全新型检测与控制技术的应用。     

抗莠去津抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建抗莠去津单链抗体基因,采用DNAStar软件对单链抗体基因进行氨基酸序列推导,用生物信息学在线网站预测莠去津单链抗体基本特性及二、三级结构。结果表明,抗莠去津单链抗体基因全长744 bp,对应248 个氨基酸,单链抗体相对分子质量约为26 061.9,等电点预测值7.81,为碱性蛋白质;二级结构中α-螺旋17 处,延伸链85 处,β-转角19 处,无规卷曲127 处;三级结构建模显示,重链和轻链的6 个环区共同组成了抗体的抗原结合区,符合单链抗体的结构特点,具有抗原结合位点的空间构象。该研究为抗莠去津单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究奠定了基础。     

A kinetic model for a biopanning process considering antigen desorption and effective antigen concentration on a solid phase

A phage display library is a powerful tool for screening ligands such as antibodies and peptides that specifically recognize a target. In this study, we established a kinetic model describing the affinity selection process of phage display libraries and verified the model experimentally. Desorption of target molecules from a solid phase and orientation of the epitopes of adsorbed target molecules are taken into account in this model. The ratio of the effective antigen density to the total antigen density was estimated to be 0.0127(+/-)0.0018 when bovine pancreatic ribonuclease A (RNase A) adsorbed on polystyrene beads was recognized by an anti-RNase A single-chain Fv phage antibody. The model can faithfully describe the recovery of the phage antibody in a round of biopanning based on the effective concentration of RNase A on the beads, the desorption rate constant of RNase A from the beads, the dissociation constant and dissociation rate constant of the phage antibody from RNase A, and the time for blocking, equilibrium and washing in the biopanning process. A recommended biopanning protocol based on the model is also described.     

抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定

从单克隆杂交瘤细胞出发,构建抗3-氨基-2-噁唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）衍生物单链抗体基因,并对其蛋白质进行理化性质分析及结构预测和活性鉴定。首先以呋喃唑酮代谢物AOZ衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞1D2为原料,提取总RNA后克隆重链（VH）、轻链（VL）可变区基因,然后使用重叠延伸聚合酶链式反应技术用连接肽(G4S)3将VH、VL基因连接构建抗AOZ衍生物单链抗体基因,经测序后采用生物信息软件对抗体编码的氨基酸序列进行推导并展开生物信息学分析,再将此基因与Plip6/GN表达载体连接后进行表达并采用直接竞争酶联免疫分析法（direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay,dcELISA）鉴定其活性。结果表明：抗AOZ衍生物单链抗体基因全长750?bp,编码250?个氨基酸,相对分子质量为27?012.20,理论等电点为9.13,属于碱性氨基酸;其二级结构预测结果显示抗体蛋白含20?处α-螺旋、25?处β-转角、114?处无规卷曲、91?处延伸带结构;三级结构预测的正面俯视图显示重、轻链由连接肽相连形成一个“环桶状”结构,侧面显示为“口袋状”,这与常规单链抗体的结构特征一致,dcELISA结果也显示该抗体具有良好的抗原结合活性。本研究为后续AOZ残留检测免疫分析方法的建立及抗AOZ衍生物单链抗体的改造奠定一定基础。     

Evolutionary affinity and selectivity optimization of a pesticide-selective antibody utlizing a hapten-selective immunoglobulin repertoire

Selectivity and sensitivity are considered as pivotal criteria for the quality of immunochemical assay designs in environmental analysis. They are essentially determined by the variable domains of the implemented antibody. The variable domains of a triazine-selective single-chain Fv (scFv) were genetically engineered by stringent molecular evolution in order to optimize analytical characteristics of the corresponding atrazine immunoassay. Gene variation of the template antibody by sequential shuffling against the variable heavy and light chain repertoire of a triazine-selective immunoglobulin library was enhanced by introducing additional point mutatons. Improved scFv variants were selected by phage display employing an atrazine derivative. By this means the paramounting affinity of the initial scFv to sebuthylazine was shifted for the mutant antibodies toward a preferential recognition of the envisaged target analyte atrazine. In addition, the detection limit of the atrazine assaywas significantly improved by factor 25 from 5.1 microg/L for the initial template antibody to 0.2 microg/L for the mutant antibodies. The contribution of the engineered antibody variants to the assay improvement is also reflected by a shift of the equilibrium dissociation constant KD from 1.27 x 10(-8) M of the template antibody to 7.46 x 10(-10) M of the optimized variant. Sequence analysis revealed a bias of amino acid substitutions in the first two complementarity-determining regions (CDR) and the flanking framework regions of both variable chains for the shuffled clones as well as a deletion in the CDR3 of the light chain. Particularly the mutations of the VL domain turned out to have a decisive impact on the alterations in the analytical performance of the engineered scFv mutants. The application of the mutant antibodies for the atrazine determination of soil samples revealed consistency with HPLC data within the experimental error.     

Construction of scFv phage display library with hapten-specific repertories and characterization of anti-ivermectin fragment isolated from the library

A specific phage display library was developed for screening antibodies against micro-molecular substances with 16-membered macrocyclic backbone. Through mRNA extraction, RT-PCR and gene splicing by overlap extension PCR (SOE-PCR), single-chain fragment variable (scFv) gene fragments about 750 bp were generated and ligated with the phagemid pCANTAB5E and were transformed into competent cells. A phage display library containing 2.4 × 10⁶ clones was constructed from milbemycin oxime-bovine serum albumin (MILO-BSA) immunized mice. The screening was carried out by ivermectin-bovine serum albumin (IVM-BSA) with different concentration levels. Furthermore, scFv phage clones were isolated within the four round library panning and screening by phage- ELISA, 10 positive clones were obtained finally. These positive clones were then sequenced, and their soluble type antibodies were identified and showed significant binding activity.