烟草白粉病抗性连锁分子标记开发及育种利用

  目的  提高烟草白粉病抗病育种效率,有效防止抗性丢失。  方法  通过烟草种质资源白粉病抗性鉴定获得抗源材料,利用F2和BCF1分离群体进行白粉病抗性遗传规律和分子标记连锁分析,开发与烟草白粉病抗性紧密连锁的分子标记。  结果  获得白粉病抗源材料2份,分别为台烟7号和KE1,其中台烟7号的白粉病抗性符合双基因隐性遗传规律。根据抗感亲本的NtMLO基因的差异开发了分子标记,利用分离群体证明该标记与白粉病抗性共分离,并应用于主栽品种的抗性回交改良。  结论  开发了与烟草Ntmlo白粉病抗性共分离的分子标记,可显著提高烟草白粉病抗病育种效率。      

烟草PVY隐性抗病基因的分子标记及其适用性

马铃薯Y 病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草的重要病害, 种植抗病品种是经济有效的防治措施。分子标记辅助选择可提高抗病育种效率。来源于X-射线诱变的Virgin A Mutante(VAM) 的隐性抗PVY 基因位点(va)被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va 位点的育种利用效率, 根据烟草隐性抗PVY 基因(感病基因)eIF4E-1 基因序列, 设计特异扩增的引物CF2GR11,开发eIF4E-1 基因的分子标记, 并检测了该标记与抗性的遗传距离和在常见烟草资源中的适用性。CF2GR11 在云烟87、红花大金元和K326 等感PVY 品种可扩增出500 bp 产物, 在NC102、NC55 和K326PVY 等抗病品种无扩增条带。以抗、感PVY 亲本构建的101 个F₂ 单株为定位群体, 遗传连锁分析表明, CF2GR11 标记与烟草PVY 感病基因的遗传距离为0.99 cM。对46 份PVY 抗性明确的栽培烟草资源的检测表明, 供试资源的标记检测结果与抗性的吻合度为100%, 表明CF2GR11 标记适用性高。该目的基因标记可用于抗PVY 育种的辅助选择和抗PVY 资源的鉴定。      

晒烟品种塘蓬烟抗白粉病基因的等位性测定和序列分析

  背景和目的  广东连江县晒烟品种"塘蓬烟"是我国特有的烟草隐性遗传白粉病抗性种质资源,但到目前为止对其抗病机制未见深入报道。  方法  利用塘蓬烟花粉与抗白粉病烟草品种Kutsaga E1及感病品种K326杂交进行抗病基因的等位性检测;利用等位基因分子标记检测塘蓬烟中感白粉病基因NtMLO1/2的突变情况;利用PCR克隆技术获得塘蓬烟NtMLO1/2基因的cDNA和gDNA序列信息,明确基因突变类型。  结果  （1）根据等位性测验结果推断塘蓬烟白粉病抗性由NtMLO1/2隐性突变基因控制。（2）等位基因分子标记检测和PCR克隆测序结果发现塘蓬烟NtMLO2基因的转录本发生外显子重复突变,形成一个新的可变剪接变异体。  结论  本研究从分子水平阐述了地方烟草品种塘蓬烟的抗白粉病机制,其结果不仅丰富了烟草抗白粉病基因资源信息,而且为日后抗性基因资源的深入研究和合理利用提供了参考依据。      

一个与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记

烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus,TMV）是烟叶生产的主要病害,为建立烟草抗TMV分子标记辅助选择体系,本研究以高抗TMV烤烟品种Coker176和易感TMV烤烟品种Y3以及它们的BC1F1群体为试材,采用分离集团分组分析法（Bulked Segregation Analysis,BSA）和简单序列重复（Simple Sequence Repeat,SSR）标记技术,筛选与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记。通过对18764对SSR引物的分析表明,有396对SSR引物在两亲本间有多态,选出1对SSR引物TM508-007扩增出的标记与TMV抗性的N基因紧密连锁,遗传连锁距离为0.41 cM,证实获得的与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记稳定可靠,可用于烟草抗TMV分子标记辅助选择。      

烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测

  目的  建立一种可同时检测烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、立枯病菌（Rhizoctonia solani）、根腐病菌（Fusarium oxysporum）和根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）5种烟草重要土传病原菌的五重PCR快速检测方法。  方法  筛选5种病原菌的特异性引物组合,通过不同的引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行优化,检测体系的灵敏度,并对土壤和植株样品进行测试,验证其实用性。  结果  根据青枯病菌fliC基因、立枯病菌RPB2基因、根腐病菌COI基因以及根黑腐病菌TEF1基因设计特异性引物,并结合已报道的黑胫病菌parA1基因的特异性引物,成功建立5种烟草土传病害的多重PCR检测方法。反应体系（25 μL）:Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1每条引物分别0.3 μL,Rf1/Rr1每条引物各1.8 μL,TBf1/TBr1每条引物各1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,退火温度为58℃,灵敏度可达到100 pg/μL。  结论  本研究建立的多重PCR体系能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤,为田间烟草土传病害的早期诊断提供依据。      

抗TMV普通烟中N导入片段的特异分子标记开发与交换单株筛选

  背景和目的  N导入片段赋予烟草品种对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）抗性,但同时带来产量低等连锁累赘,为了筛选减少连锁累赘的交换单株。  方法  以普通烟草中的N导入片段为材料,利用茄科作物基因组序列数据和比较基因组学方法,开发了特异扩增N导入片段的系列分子标记,通过分子标记在种质资源和分离群体中筛选交换单株。  结果  开发出23个N导入片段特异的分子标记,将携带N导入片段的普通烟种质划分为Coker176、Samsun NN和Xanthi nc三种长度类型。供试90份抗TMV的普通烟资源中,85份属于N导入片段长度相对较短的Coker176类型,未发现比Coker176更短的种质资源。利用N导入片段末端分子标记TN5.51,从不含N基因的K326、Y87、5F、HD与Coker176配置的4个回交分离群体的22572株抗TMV单株中,筛选到11株N导入片段交换单株,Coker176类型的N导入片段在普通烟中的交换频率为0.049%。其中24-8H等3个单株的N导入片段缩短约一半,具有减少连锁累赘的潜力。  结论  本研究获得了普通烟中N导入片段的系列分子标记和长度缩短一半的交换单株,为解析N导入片段连锁累赘的分子机理、减少连锁累赘奠定了基础。      

烟草青枯病抗性与分子标记的关联分析

为了找到与烟草青枯病抗性相关的分子标记、加快抗病品种的选育,以78份烟草种质为自然群体材料,选用20对简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)和37对微卫星锚定片段长度多态性(Microsatellite-anchored Fragment Length Polymorphism,MFLP)引物组合对烟草种质材料进行基因分型,并利用等位变异数据进行主成分分析和群体结构分析,同时采用TASSEL3.0软件对烟草青枯病抗性与等位变异进行连锁不平衡关联分析。结果显示:SSR和MFLP标记在78份烟草种质中共检测到252个等位变异,主成分分析和群体结构分析均将烟草种质分为5个组群;关联分析发现6个MFLP标记位点与烟草青枯病抗性显著相关,对青枯病抗性的解释率在8.33%~19.49%之间。这些分子标记可为评价具有青枯病抗性潜力的烟草种质材料提供依据。      

烤烟CMV抗性基因QTL定位

利用SSR 技术,在抗CMV 烟草中发掘与抗病基因紧密连锁的分子标记,目的是为抗病基因的定位克隆以及培育抗病新品种奠定基础。本研究以抗CMV 的烤烟品种台烟8 号、感病品种NC82 为亲本,构建BC₁ 代分离群体,对其进行抗性遗传分析。对分布于烟草24 条连锁群上的2317 个SSR 位点进行了多态性筛选,获得了62 个稳定多态性标记,利用这些标记对288 株BC₁群体分型数据,用WinQTLCart2.5 进行分析,找到一个与抗性相关的QTL,LOD 值为2.6。研究结论表明,台烟8 号对CMV 的抗性由多基因控制,标记53735 与抗性QTL 紧密连锁,遗传距离为0.1 cM,该QTL 位于10 号连锁群,贡献率为13%。     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

烟草黑胫病抗性鉴定研究现状与展望

从抗病鉴定方法、种质资源与新品种（系）抗病鉴定方面概述了烟草黑胫病抗性鉴定研究进展。重点评述了烟草苗期菌谷法、游动孢子浸根法和毒素法,烟草成株期人工病圃法,以及分子标记辅助法等抗性鉴定方法进展;回顾了我国烟草种质资源与新品种（系）的抗病鉴定工作历程;针对抗源利用、抗病鉴定技术、工作程序上存在的一些问题提出了相应的对策与思路。      

引进美国烤烟新品种(系)的抗性检测与评价

为选育和利用抗病品种、有效防治烟草病害,采用人工诱发抗性鉴定方法对引进的13个美国烤烟品种(系)进行了烟草黑胫病、烟草普通花叶病(TMV)和赤星病的抗性测定,并采用分子标记方法对黑胫病和TMV进行了辅助检测。结果表明:NCT5、NCT6、NCT7、NCT8、NCT9、NCT10和NCT13抗黑胫病,NCT1、NCT4、NCT11和NCT12中抗黑胫病,抗病分子标记辅助检测中仅有4个烤烟品种NCT6、NCT9、NCT12和NCT13检测出Ph基因,其余品种未检出含有Ph基因。NCT1、NCT8、NCT11和NCT4中感赤星病,NCT12、NCT10、NCT2、NCT13、NCT9、NCT3、NCT7、NCT6和NCT5中抗赤星病。NCT13、NCT10、NCT9、NCT12、NCT6、NCT4、NCT1、NCT2、NCT11、NCT7和NCT8感TMV,NCT5和NCT3中感TMV。PCR分析表明,所有供试品种(系)均不含N基因,与抗性鉴定结果中13个供试品种(系)对TMV均表现感病和中感的结果相吻合。      

烟草种质的SSR标记遗传多样性及青枯病抗性的关联分析

烟草青枯病是影响烟草产质量的主要病害之一,开发出与烟草青枯病抗病性密切相关的优异等位基因,可加速抗病品种的选育进程。据此,本研究选用94份烟草种质材料作为研究对象,运用236个SSR标记对这些材料进行基因分型和群体结构分析,开展基于连锁不平衡的关联分析探测与青枯病抗性相关的分子标记。结果表明,236个SSR标记在94份烟草种质中检测到904个等位变异位点,平均每个SSR标记为3.83个位点;这些SSR标记的多态性信息量（PIC）值在0.1361~0.8760之间,平均为0.5136。基于SSR基因分型数据,构建了126个标记单倍型;在此基础上进行群体结构分析,将94份种质划分为2个类群,表明本研究烟草种质的群体结构简单,有利于减少伪关联。二年田间抗病性数据与单倍型的关联分析发现7个单倍型与青枯病抗病性密切相关,其中有3个单倍型在二年的田间试验中均表现出与青枯病抗性密切相关,平均解释率超过10%。研究结果可为烟草青枯病抗病材料的分子标记辅助筛选提供参考。      

烟草种质材料TSNA含量的关联分析

摘要:利用分布于烟草24个染色体的具多态性的SSR标记和MFLP标记,分析24份烟草种质材料的遗传多样性,在此基础上对烟叶中烟草特有亚硝胺（TSNA）含量的表型变异与标记多态性进行关联分析。结果显示,33对MFLP引物和28对SSR引物在24份烟草材料中共发现188个多态位点;群体结构分析将24份烟草材料分为3个亚群,且亚群划分与烟草类型（烤烟、晾晒烟和白肋烟）基本一致;关联分析发现1个SSR位点和6个MFLP位点至少与1种TSNA含量的相关性在P<0.01水平上显著,其中标记MFLP26与烤后烟叶中NNN含量的相关性极显著（P<0.001）,表型变异解释率最高（R2=0.5831）。因此,这些显著关联的分子标记可为筛选低TSNA含量的烟草材料提供参考。      

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。      

五个烟草野火菌株的生理小种鉴定

  背景和目的  针对目前国内尚未以国际通行的抗性鉴别宿主区分烟草野火菌的生理小种, 首次基于抗性遗传规律鉴定了所收集野火菌株的生理小种归属。  方法  通过大田喷雾接种、温室浓度梯度接种、无损伤接种及同一叶片上的对比试验等4个平行试验, 将ATCC11528等5个野火菌株接种到黄花烟等6个不同抗源遗传背景的烟草上, 根据不同试验出现的不同病理反应对各野火菌株进行生理小种分类。  结果  所收集的5个野火菌株经多轮分子标签鉴定纯化, 可用于接种试验。野火菌株D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分别被鉴定为0、1、3等3个小种。  结论  采用国际通行的抗性鉴别宿主和4个平行接种试验区分了5个野火菌株的生理小种归属。为培育野火菌小种专化抗病烟草和克隆烟草中小种专化抗病基因提供了重要基础。      

烟草青枯病抗性基因的遗传分析及RAPD标记

选用高感青枯病品种"红花大金元"与高抗青枯病品种"Ti448A"配制杂交组合,采用温室苗期叶片人工注射法接种鉴定两亲本及其杂交后代F₁、F₂、BC₁P₁代的青枯病抗性表现,结果表明抗病亲本材料Ti448A的抗病性由一对显性基因控制。依据混合群体分组分析法(BSA)建立抗青枯病基因池和感青枯病基因池,通过RAPD试验,从近200个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物S503,用双亲、F₁、F₂单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记,利用JOINMAP (version 1.4)软件计算得此标记与抗青枯病基因间的重组率为5.984%,连锁距离为6.261 cM。      

RAPD标记在烟草研究中的应用

随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNAs,RAPD)分子标记技术的诞生,为分子生物学技术在农业研究中的应用注入了新的活力,并为传统农业研究向分子水平发展提供了捷径。本文重点综述了RAPD分子标记技术在烟草群体分离分析和鉴定、标记辅助选择、遗传变异的识别、烤烟品种分子指纹分析、黑胚病菌全基因组DNA多态性标记、根结线虫种类鉴定、赤星病菌的分类地位等方面的研究进展,以及这些领域的研究发展和应用前景。      

一个与净叶黄抗赤星病基因紧密连锁的SSR标记

为了在分子水平上弄清烟草赤星病抗性的遗传规律,并进行遗传定位,以抗赤星病品种净叶黄和感赤星病品种NC82为亲本,构建了F₁、F₂、BC₁ 代群体。通过对该群体进行赤星病接种鉴定和抗性遗传分析,发现净叶黄对赤星病的抗性由显性多基因控制。通过分子标记群体扩增,在第M号连锁群上,筛选到一个与净叶黄的赤星病抗性基因紧密连锁的SSR标记,它与抗性基因间的遗传距离为4 cM。该标记可用于抗赤星病育种的辅助选择。     

红花大金元品种抗黑胫病和TMV的定向改良

正1红花大金元品种抗黑胫病定向改良云南省烟草农业科学研究院利用烟草基因组序列图谱和遗传连锁图谱(图1),对烟草抗黑胫病基因进行了精细定位,开发了用于抗黑胫病和背景选择的分子标记(图2),经四代回交、全基因组范围的分子标记辅助选择和表型鉴定,获得了高抗黑胫病的改良红花大金元新品系(图3),2016年8月1日通过了国家局科技司和中国烟叶公司共同组织的田间鉴评(图4)。