酒鬼酒发酵车间空气源细菌系统发育多样性研究

本研究采用空气自然沉降法和纯培养法从酒鬼酒发酵车间收集分离空气中可培养细菌(含放线菌),运用基于16S rRNA基因序列的系统发育分析法对菌株进行多样性研究。用添加10%酒鬼酒酒醅浸汁的营养琼脂、麦芽膏-酵母膏和高氏一号培养基,从酒鬼酒发酵车间分离纯化到127株细菌菌株。根据形态观察和部分生理生化实验去冗余,选取72株具有代表性的菌株,对其进行基于16S r RNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明,这些分离菌株具有较高的类群多样性,分属于细菌域的4个门(Actinobacteria, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Proteobacteria)的17个科(Aurantimonadaceae, Bacillaceae, Bacillales Family Ⅻ, Corynebacteriaceae, Deinococcaceae, Intrasporangiaceae, Microbacteriaceae,Moraxellaceae, Nocardiaceae, Planococcaceae, Propionibacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Rhodobacteraceae, Sphingomonadaceae, Staphylococcaceae, Xanthomonadaceae)的24个属(Acinetobacter, Agrococcus, Arsenicicoccus, Arthrobacter, Aurantimonas, Bacillus, Corynebacterium, Deinococcus, Exiguobacterium, Janibacter, Kocuria, Luteococcus, Microbacterium, Micrococcus, Paracoccus, Pararhodobacter, Pseudomonas, Rhodococcus, Shinella, Sphingomonas, Sporosarcina, Staphylococcus, Virgibacillus, Xanthomonas)。优势类群为Actinobacteria门(34株,47.22%),其中Micrococcaceae为优势科,含15株菌株;其次是Proteobacteria门(24株,33.33%)和Firmicutes门(11株,15.28%),还分离到3株属于分类名称尚未确定且目前根据《伯杰氏细菌手册》暂称为异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)的细菌。这些菌株可分为53个物种,大部分菌株与其系统发育关系最密切的已知物种的典型菌株之间存在一定的遗传差异(16S rRNA基因序列相似性为96.37%～99.88%)。其中至少有5株(JSM 2215019、JSM 2215034、JSM2215039、JSM 2215042和JSM 2215109)可能代表潜在的新的分类单元(potential new taxa),它们可能分别代表Sphingomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Paracoccus和Deinococcus属的潜在新种。以上结果表明,酒鬼酒发酵车间空气中存在较为丰富的细菌多样性,并且可能潜藏着新的微生物类群(物种)。     

酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌的系统发育分析和胞外酶学特征

从酒鬼酒窖池中采集成熟酒醅样品,用纯培养法进行芽孢杆菌分离纯化,采用16S rRNA基因序列分析法进行系统发育分析,采用水解法对其胞外酶学特征进行观察。采用NA和LA培养基分离纯化得到104株细菌菌株,根据形态特征和产芽孢特征,去除部分冗余,选择28株代表性芽孢杆菌用于进一步研究。系统发育分析结果表明,这28株芽孢杆菌具有较高的类群多样性和物种多样性,属于细菌域(Bacteria)厚壁菌门(Firmicutes)的2个科(Bacillaceae、Paenibacillaceae)的3个属(Bacillus、Brevibacillus、Virgibacillus),分为10个物种。芽孢杆菌属(Bacillus)占绝对优势,共26株(92.9%);其余2株JSM161009和JSM 166025分属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)。胞外水解酶学特征观察结果表明,至少产生一种酶的菌株共27株(96.4%)。其中有20株(71.4%)淀粉水解酶阳性,19株(67.9%)明胶水解酶阳性,27株(96.4%)尿素水解酶阳性,21株(75.0%)对4种吐温(20、40、60、80)之一水解活性阳性。在28株受试菌株中,有8株(JSM 161009、163010、163017、166014、167011、167021、168017、168019)水解酶谱较广。这8个菌株均属于芽孢杆菌科(Bacillaceae),其中1株(JSM161009)属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus),其他7株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。     

酒鬼酒成熟糖化料细菌的分离和系统发育多样性分析

采集酒鬼酒成熟糖化料样品,采用纯培养法以3种基础分离培养基分离样品中的细菌(含放线菌),采用16S rRNA基因序列分析法对分离菌株进行发育多样性分析。用营养琼脂(nutrient agar)、LA(Luria-Bertani agar)和海洋琼脂(marine agar)培养基进行分离,得到82个细菌菌株。根据菌落形态、细胞形态和革兰氏染色实验结果,去除部分冗余,最终得到47个代表性菌株。系统发育分析结果表明,所得47个代表性菌株分属于细菌域(Bacteria)的5个大的系统发育类群/门(phylogenetic group/phylum),近半数菌株(23株,48.9%)属于厚壁菌门,其中优势菌群为芽孢杆菌科(Bacillaceae)的芽孢杆菌属(Bacillus),共有11个分离菌株(23.4%)。这47个代表性菌株可以归为31个不同物种,且大多数与它们的系统发育关系最密切的已知物种的典型菌株之间存在一定的遗传差异,16S r RNA基因序列相似性处于96.52%～99.73%之间。其中有2个菌株(JSM 2032011,JSM 2032014)与其系统发育关系最密切的已知物种的典型菌株之间的16S rRNA基因序列相似性较低,可能代表潜在的新分类单元(potential new taxa)。菌株JSM 2032011与假单胞菌属(Pseudomonas)的Pseudomonas hunanensis LVT的系统发育关系最密切,但它们之间的序列相似性较低(97.54%);菌株JSM 2032014与赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)的Lysinibacillus jejuensis N2-5T的系统发育关系最密切,它们之间的序列相似性只有96.52%。而且这2个菌株在系统发育树上在各自的簇群中形成了独立的进化分支。因此,菌株JSM 2032011和JSM2032014可能分别代表了假单胞菌属和赖氨酸芽胞杆菌属的潜在新种(potential new species)。以上结果表明,酒鬼酒成熟糖化料分离的细菌具有较高的类群多样性和物种多样性,且蕴含着一些新的微生物类群/物种。     

青海牧区产凝乳酶细菌多样性分析

为发掘性能优良的产凝乳酶细菌菌株,开发新型细菌凝乳酶。本文采用酪蛋白培养基从采自青海牧区土壤样品分离筛选产凝乳酶细菌,利用菌株16S rDNA基因序列对菌株进行鉴定并分析其多样性。结果表明,36个样品中分离得到21株产凝乳酶细菌,沉淀圈与菌落直径比值为1.41~5.5;分离菌株在不同培养基上凝乳酶和蛋白水解活性有明显差异,麸皮汁培养基中凝乳酶活性为11.3~1215.6 SU/mL,蛋白水解活力为14.6~59.5U/mL;21株菌中有14株菌属芽孢杆菌属(Bacillus),是产凝乳酶细菌的优势属;多样性指数分析表明,该地区产凝乳酶细菌具有丰富多样性。     

发酵初期豆瓣酱中微生物多样性分析及产酶菌株的筛选

为了探明发酵初期(发酵70 d)豆瓣样品中微生物的多样性及产酶菌株对豆瓣风味的影响,采用纯培养的分离方法对分离菌株进行了细菌16S r RNA系统发育分析;同时用选择培养基对产中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶的菌株进行了筛选。结果表明,发酵初期豆瓣样品微生物种类丰富,总共分离得到80株菌株分属于11个属(Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia、Aspergillus、Candida、Wickerhamomyces、Enterobacter和Gracilibacillus)。筛选出的34株典型菌中,产中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的比例分别为21%,24%,38%和56%。     

苗家白酸汤中微生物群落多样性研究及其优势微生物的筛选

以贵州传统特色民族食品苗家白酸汤为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术对白酸汤中微生物的群落组成及多样性分析;结合传统可培养技术对白酸汤中优势微生物进行筛选,以糯米粉为发酵底物,模拟白酸汤发酵试验筛选发酵性能较好的优势菌株,并对其进行分子生物学鉴定。结果表明:白酸汤中主要优势微生物为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces);共筛选到发酵性能较好的优势菌株20株,其中干酪乳杆菌4株,副干酪乳杆菌2株,细菌菌株2株,酿酒酵母8株、克鲁维酵母2株、毕赤酵母2株。其中干酪乳杆菌MY4-1产酸量最高,达1.392±0.024 g/100 g;酿酒酵母YJ24菌株降糖率达72.84%;干酪乳杆菌TLM3-2、马克斯克鲁维酵母YJ1、曼氏毕赤酵母YX5等菌株感官得分较高。     

摩洛哥自然发酵驼乳中乳酸菌分离鉴定及特性研究

为了丰富菌种资源库资源,探索乳品细菌多样性及菌株生化特性,对摩洛哥阿尤恩地区4份自然发酵驼乳的乳酸菌应用传统纯培养方法和宏基因组16S rRNA基因测序技术进行分离、鉴定,同时对细菌宏基因组测序进行多样性研究及单菌株生化特性研究。由纯培养结果可知:4份样品中分离乳酸菌株包含3个属、8个种,共82株乳酸菌,其中58.54%为Lactococcus lactis;根据宏基因组测序结果可知:4份样品中分离的细菌分属于7个门、78个属和147个种,Proteobacteria(54.64%)和Firmicutes(41.77%)是样品中的优势菌门,Lactococcus(31.87%)及Lactococcus lactis(22.95%)占比较高,是样品中优势菌属及菌种。通过比较不同乳酸菌在相同环境下的生长情况及产酸速率,从样品中分离得到的48株Lactococcus lactis中筛选得到2株生长快、产酸速率高的菌株IMAU98054和IMAU98084。2株菌最适生长温度为37℃,pH值为5.5~7.5,且有一定的盐耐受性,NaCl质量分数小于6%时生长不会受到明显抑制。2种菌株在37℃发酵18h后其OD₆₀₀可达到2.5218和2.5172。研究结果表明:摩洛哥阿尤恩地区自然发酵驼乳中包含多类细菌,Lactococcus lactis是其中的优势菌种,并从其中筛选出2株生长快、产酸速率高的菌株IMAU98054和IMAU98084。     

酱块发酵过程中真菌和细菌群落的演替

豆酱是中国传统的发酵豆制品。酱块制作是豆酱发酵的前期阶段,为后期发酵提供丰富的微生物和酶制剂,对豆酱的品质至关重要。为了探究自然发酵豆酱酱块发酵过程中微生物多样性,采用第二代测序Illumina MiSeq方法对采集自开原的4个不同发酵阶段的酱块样品进行微生物多样性分析。结果表明:在属级水平上,共鉴定出21个真菌分类群,其中毛霉菌(Mucor)、青霉菌(Penicillium)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和根霉菌(Rhizopus)为优势类群;细菌共鉴定出40个细菌分类群,其中乳杆菌(Lactobacillus)、魏斯氏菌(Weissella)和肠球菌(Enterococcus)为优势类群。豆酱酱块中多样性的真菌和丰富的细菌在发酵过程中可能共同发挥特定的作用。本研究阐明了传统发酵豆酱酱块的微生物群落特征,揭示了传统酱块发酵过程中真菌和细菌的群落演替,为豆酱发酵过程控制奠定了理论基础。     

郫县豆瓣中可培养细菌多样性分析及酶活性初筛

为了将现代生物科学技术应用于传统食品生产的研究和改良,应用纯培养方法和基于16SrRNA基因序列的系统发育分析,对郫县豆瓣中的细菌进行了研究,对所得的219株纯培养细菌经去重后的35株典型菌株进行了16SrRNA基因测序和多样性分析。研究结果表明,郫县豆瓣中细菌多样性丰富,包含8个属,其中Bacillus是优势类群,占所有菌株比例达59.8%;另外还含有Myroides(11.4%),Providencia(5.72%),Alcaligenes(5.72%),Massilia(2.86%),Virgibacillus(2.86%),Morganella(2.86%),Geobacillus(2.86%),Fictibacillus(2.86%)。淀粉酶和蛋白酶筛选结果表明,豆瓣细菌具有良好的产酶活性,其中产蛋白酶的阳性菌株占70.1%,产淀粉酶阳性菌株占64.8%。该研究为豆瓣的大规模现代化生产提供了理论基础和生产材料。     

天山一号冰川融水中耐冷酵母菌多样性及系统发育

分离和筛选天山一号冰川融水中可培养的酵母菌,了解冰川中低温酵母菌的生长特性、系统发育和物种多样性,为低温酵母菌资源的收集保护及开发其生物技术利用潜力奠定基础。采用虎红培养基RB分离菌株,对分离菌株的最适生长温度、最适p H及耐盐性进行测试;通过选择性培养基分别测试了菌株的产胞外酶性状,利用26S rRNA基因序列分析确定低温酵母菌种的系统进化地位,并通过MSP-PCR指纹技术对26S rRNA基因高度同源性的菌株做进一步区分。共得到68株低温酵母菌,依据菌落形态、细胞形态进行初步分群,选取具有代表性的15株进行测序,结果显示15株酵母菌株隶属于担子菌(Basidiomycetes)和子囊菌(Ascomycetes),共7个属,只有BCY-12隶属于子囊菌的Pichia属,其他菌株全部属于担子菌,其中隐球酵母属(Cryptococcus)占40%。菌株产酶性状研究显示,7株可产脂肪酶,4株可产酯酶,11株可产淀粉酶,11株可产蛋白酶,3株可产果胶酶,2株可产几丁质酶。天山一号冰川融水中具有较丰富的低温酵母菌,系统发育多样,产酶特性差异较大。分离菌株大多属于耐冷菌范畴,Cryptococcus属的菌株为优势种群。     

谢村黄酒酒曲微生物多样性分析及产γ-氨基丁酸能力的初步研究

探究谢村黄酒酒曲微生物多样性,筛选产功能性成分菌株,为谢村黄酒的品质研究提供理论依据。采用分离培养法结合高通量测序技术分析酒曲微生物多样性;通过薄层层析法定性筛选、异硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相色谱法定量筛选,得到产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的菌株。结果表明:酒曲中细菌可划分为48个属,优势属为克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)等;真菌可划分为18个属,主要为耐干霉菌属(Xeromyces)、横梗霉属(Lichtheimia)、根毛霉属(Rhizomucor)等。分离培养出细菌及真菌共27株,其中6株具有产GABA的能力,占总菌数22%。其中优势菌芽孢杆菌属菌株N1产GABA的能力最高,产量达0. 78 g/L。研究探明了谢村黄酒酒曲中优势微生物及其产GABA的能力,为通过调控微生物来改善黄酒品质,开发功能性黄酒提供了科学参考。     

仿刺参肠道可培养微生物多样性研究

为了解大连地区仿刺参肠道可培养微生物种群的多样性信息,用2216、TCBS和葡萄糖琼脂培养基从大连地区冬、春两季的仿刺参肠道中共分离得到141株细菌,通过16SrDNA-RFLP分析后,得到17个不同的类群。从各个类群中随机选取代表菌株进行16SrDNA序列测定和系统发育分析,结果表明,大连地区仿刺参肠道细菌主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）,弧菌属（Vibrio）,芽孢杆菌属（Bacillus）,希瓦氏菌属（Shewanella）,交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）,不动杆菌属（Acinetobacter）,气球菌属（Aerococcus）,发光菌属（Photobacterium）,葡萄球菌菌属（Staphylococcus）和Kushneria菌属共10个菌属。说明大连地区仿刺参肠道可培养微生物具有一定的多样性。     

五粮浓香型白酒窖房和曲房空气细菌相关性的初步研究

从宜宾华夏酒业窖房和曲房空气中分离得到44株细菌,对所得菌株进行了16S rDNA基因系统发育及部分酿造特性分析。窖房和曲房空气的细菌在属和种一级的相似性分别为40.0%和36.4%,且均以Bacillus cereus、Bacillus anthracis细菌为优势种,表明2个细菌群落具有一定的相似性。分离自窖房空气的菌株有20株（占95.2%）耐受7%的无水乙醇,2株菌耐受pH4.5,且分别有2株、9株能够产纤维素酶和淀粉酶;分离自曲房空气的菌株均不耐受7%的乙醇和pH4.5,产纤维素酶和淀粉酶的菌株分别有6株、3株。结果表明,经过长期的酿酒生产,曲房和窖房空气中均形成了较为稳定的细菌区系,其菌落组成与酿酒生产存在较为密切的相关性。在生产中,2个细菌群落之间存在广泛的交流。     

多粮浓香型酒厂空气中霉菌多样性研究

对长期生产的酿酒区域内和区域外空气中霉菌种类和数量进行比较研究.结果表明,生产车间内霉菌的种类和数量显著高于厂区和厂区外.制曲车间空气中的霉菌种类和数量最多,分别占分离菌株总数的43.1%和分类总属数的68%;发酵车间次之,分别为38.9%和46.4%;而其他3个采样点一共占18%和25%.在生产车间空气中,霉菌存在一定程度的多样性和特殊性,葱花霉属Oedocephalum Prenss为优势属.     

川西高原牦牛酸奶子乳酸菌遗传多样性及系统发育研究

采用16S rDNA基因的限制性酶切片段长度多态性分析(16S rDNA-PCR-RFLP)和16S～23S rDNA基因间区(ISR)的酶切多态性分析(ISR-PCR-RFLP)技术,研究分离自川西高原牦牛酸奶子的81株乳酸菌的遗传多样性,并结合16S rDNA序列分析技术研究16S rDNA-PCR-RFLP的各类群代表菌株的系统发育关系。结果表明：供试菌株共有23种16S rDNA遗传型,供试菌株按61%相似系数可分为4个类群,按81%相似系数,可分为16个类群,结合序列分析结果,乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)细菌为主要类群;16S～23S rDNA基因的ISR扩增产物的酶切分析表明,供试菌株共有19种ISR遗传型,按60%相似系数,供试菌株可分为4个类群,按80%相似系数,供试菌株可划分为14个类群。     

烟草可培养内生细菌16S rDNA的PCR-RFLP和系统发育分析

为了解烟草内生细菌的多样性,采用改良的NA培养基和稀释平板法从不同生长期的烟草的根、茎、叶中分离得到127株内生细菌.利用细菌16S rDNA特异引物扩增得到16S rDNA的部分片段,长约700 bp,分别用内切酶MspⅠ、HaeⅢ、AfaⅠ、HinfⅠ对扩增产物进行限制性酶切.16S rDNA PCR-RFLP分析中,在100％相似性水平处,除了cj23、ty16、cg23、wy6、cj25、wy13、my23、ty7、cj14、cg25、cg2、cj13、my11,my27单独成群外,其余菌株分为15个分类操作单元,其中Otu1、Otu2,Otu27类群最大,分别包括了27、18,26个菌株.对29个代表菌株16S rDNA序列系统发育分析表明,这些菌株主要分布于芽孢杆菌(Bacillus)分支,其余菌株分布于葡萄球菌属(Staphylococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、单胞菌属(Sphingomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、纳西杆菌属(Naxibacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯菌属(Klebsiella)、Bifissio属系统发育分支.通过Shannon多样性指数对不同生长期分离到的菌株进行多样性分析和比较,结果表明团棵期叶片中分离到的内生细菌多样性最大,随后是旺长期,苗期次之,成熟期最小.     

浓香型白酒发酵黄水中微生物群落结构解析

运用传统培养和构建SSU r RNA文库的方法探索发酵黄水中微生物多样性。所获得的151个细菌克隆子分别归为变形菌门、柔膜菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、黏胶球形菌门及放线菌门等6个门以及一个未分类类群,其中厚壁菌门(47.6%)、变形菌门(29.1%)为主要类群。在种属分类水平上,梭菌属(25.8%)、乳酸菌属(15.9%)和沙雷氏菌属(14.6%)为优势菌群。随机选择的37株古菌克隆子均属于广古菌门、甲烷微菌纲,其中以A13为代表甲烷八叠球菌属古细菌(59.5%)及以A8为代表的产甲烷囊菌属(35.1%)占古菌数量的绝大多数。细菌和古菌克隆文库的多样性指数(香浓指数H)分别为2.75和0.83、优势度指数12.88和2.14、盖度指数99.9%和100%。物种鉴定结果显示,黄水中多数微生物为功能性微生物,在营养物质代谢、酸、醇、酯、醛、酮等功能成分合成方面发挥着重要作用,是浓香型白酒香味物质的来源与基础之一。     

酒曲中高产蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的筛选与分子鉴定

白酒酒曲中的蛋白酶和α-淀粉酶在酒类的糖化发酵过程中起到了重要作用,能够有效地水解原料,加快发酵速率。对从酒曲中获得的30株霉菌进行蛋白酶和α-淀粉酶产生菌的筛选,结果表明,产蛋白酶的菌株有15株,占全部测试菌株的50%;产α-淀粉酶的菌株有9株,占全部测试菌株的30%。其中菌株Y27具有最好的蛋白酶活(酶活性为324.72 U/m L)和α-淀粉酶酶活(225.76 U/g干曲)。因此,Y27菌株具有很好的酿酒开发潜力。系统发育分析表明,菌株Y27与Aspergillus oryzae同源性最高,其序列相似性为99.8%。此研究为米曲霉应用于酿酒工业提供了思路。     

宜宾多粮型白酒窖房空气中产糖化酶的霉菌

对分离自窖房空气中的104株霉菌产糖化酶能力进行检测,发现其中有14株具备产糖化酶能力。结合形态、特征和基于ITS nu-rDNA的系统发育分析,此14株菌分属于Aspergillus（6株）、Mucor（3株）、Penicillium（2株）、Rhizopus（1株）、Gibberella（1株）、Cladosporium（1株）6个属,Aspergillus为优势属,显示浓香型白酒窖房中空气存在多样性较为明显的产糖化酶霉菌。     

泸型酒酿造期间酒醅中可培养细菌的分离鉴定及其种群演替规律研究

目的:为了系统的探究泸型酒酿造期间酒醅中细菌的多样性及演替变化规律,尽可能多的得到各时期可培养的占主体地位的细菌。方法:选用三种不同的培养基对各时期的酒醅样品进行分离计数,并通过16S rRNA基因序列分析法对分离得到的纯菌进行鉴定和系统发育分析。结果:分离得到258株细菌,其中250株分别属于29个种,其余8株鉴定到属(芽孢杆菌属)。在发酵过程中占优势的主体细菌主要为芽孢杆菌属,乳酸菌属细菌在发酵中期也较多。结论:泸型酒发酵过程中细菌的多样性很丰富,发酵前期细菌种类比较多,中期主要以乳酸菌属和芽孢杆菌属为主,后期芽孢杆菌属为主体。可以推测出乳酸菌属和芽孢杆菌属细菌对泸型酒的酿造形成具有特殊意义。