黑芥ANS基因的克隆和在芸薹属B基因组的PCR鉴别

利用同源克隆方法克隆黑芥ANS基因,获得2个ANS基因拷贝BnANS1和BnANS2,长度分别为1 366bp和1 367bp.这2个基因都有1个76bp的内含子.比较BnAⅣS1和BnANS2基因序列,发现在编码区、5＇与3＇非编码区和内含子区域都有多态性,5＇非编码区有3个碱基的多态性和4个碱基的缺失,编码区有26个碱基的多态性;内含子有2个碱基的多态性;3＇非编码区有18个碱基的多态性和3个碱基的插入.这2个ANS拷贝都编码356个氨基酸的蛋白,具有其他物种同样的ANS蛋白保守结构域,属于2OG-Fe（Ⅱ）加氧酶超家族.BnANS1编码的蛋白质理论分子量为40 448.58Da,等电点为5.05;BnANS2编码的蛋白质理论分子量为40 468.52Da,等电点为5.04.比较这2个ANS基因拷贝编码的蛋白质序列,发现有9个多态性位点.这2个ANS拷贝在黑芥的种皮和胚中均检测到表达.获得了1对ANS引物,能从白菜、黑芥、甘蓝、芥菜型油菜、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中,用等位特异PCR方法特异识别来自芸薹属B基因组的ANS基因.     

贝酵母耐硫相关基因FZF1的克隆与分析

FZF1基因在酿酒酵母中对亚硫酸盐转运蛋白编码基因SSU1具有正向调节作用,但在贝酵母中尚无相关报道,本研究拟通过对该基因进行克隆和生物信息学分析为后续研究做出参考。首先对贝酵母FZF1基因进行克隆,并利用在线分析工具Prot Param、Prot Scale、TMHMM、Predict Protein、Swiss-Model等软件对其编码蛋白质的基本理化性质进行分析,同时预测了该基因所编码蛋白质的二级结构和三级结构。结果表明:该核苷酸序列含有一个长900 bp的开放阅读框,可编码299个氨基酸;编码的蛋白质为在细胞核中行使调控功能的亲水蛋白,含有18个丝氨酸(S)激酶潜在磷酸化位点、一个Coil区和4个锌指结构域,与酿酒酵母FZF1基因所编码的蛋白质结构和性质极为相似。可初步认为贝酵母FZF1基因与细胞的耐硫性相关;而贝酵母FZF1基因所编码的蛋白质中仅有4个锌指,则可能是贝酵母硫耐受能力比酿酒酵母弱的重要原因。     

酸性蛋白酶基因Asp在红曲霉中的同源表达及序列分析

从红曲霉基因组中扩增出酸性蛋白酶基因Asp的编码区,构建其同源表达载体p BC-Hygro-Asp并导入到农杆菌GV3101备用。利用根癌农杆菌介导法将重组质粒导入红曲霉,并筛选获得Asp基因同源重组转化子,实现了酸性蛋白酶基因在红曲霉中的同源表达。转化子中酸性蛋白酶基因表达量是野生型菌株的3.30倍,能达到高产酸性蛋白酶的目的。对红曲霉酸性蛋白酶基因序列进行分析,结果显示该基因产物有两个天冬氨酸蛋白酶活性位点,为亲水性分泌蛋白,不参与信号转导,且与赤曲霉酸性蛋白酶有相同进化速率。     

红曲霉中桔霉素定量分析及其合成相关基因簇的研究

目的对红曲霉中真菌毒素桔霉素进行定量分析,并研究桔霉素合成相关基因簇,为从基因水平上对桔霉素的产生进行调控、提高红曲霉相关食品的安全性提供理论依据。方法采用高效液相色谱(HPLC)法对3株红曲霉(紫色红曲霉YY-1、M2,丛毛红曲霉FJ-1)在液态发酵过程中产生的桔霉素开展定量分析,采用二代测序技术鉴定桔霉素合成基因簇的序列特征,应用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法进行相关基因表达水平分析。结果在固态培养和液态发酵过程中,3株红曲霉菌体生长情况无明显差异;在液态发酵过程中,HPLC结果显示M2桔霉素产量最高,其次为YY-1,FJ-1产量最少;M2、YY-1、FJ-1桔霉素合成基因簇相似度达99.9%;膜转运蛋白基因(orf5)、聚酮合酶基因(pksCT)、氧化还原酶基因(ctnB)、转录调节蛋白基因(ctnA)、脱氢酶基因(orf1、ctnE)六个基因表达水平在M2中最高,在FJ-1中最低。结论桔霉素的产量差异与桔霉素合成基因簇所表达酶的种类无关,而与其基因表达的调控相关。     

葡萄汁酵母NOT5基因生物信息学分析

目的:从转录组分析数据中得到葡萄汁酵母NOT5基因,并对其进行生物学信息分析,为后期研究该基因的作用打下基础。方法:使用在线分析工具COILS Server、SOPMA、Alpha Fold 等分析预测NOT5基因编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构及其结构域。结果:葡萄汁酵母NOT5基因核苷酸序列的开放阅读框为1446 bp,可编码481个氨基酸,位于XVI染色体690107~691789,在系统发育树中与真贝酵母（Saccharomyces eubayanus NOT5 like protein XP018219088.1）NOT5基因的亲缘关系最近;其编码的蛋白质是不稳定的亲水蛋白,分子式为C₂₄₉₃H₃₈₄₈N₆₅₄O₇₉₅S₁₉,分子质量为56311.02,不含信号肽,无跨膜区域,存在卷曲螺旋区域,亚细胞定位于细胞质中的线粒体上;蛋白质的二级结构以随机卷曲为主;预测存在Pfam Not3和Pfam NOT2_3_5结构域;以Yeast Not1-Not2-Not5 (4by6.1.C)为模板构建NOT5蛋白的三级结构,两者的序列一致性可以达到89.88%。结论:葡萄汁酵母NOT5基因编码的蛋白结构不稳定,可能在细胞中互连翻译和转录。     

红曲霉的分离纯化及酯化酶活性研究

从汾酒生产环境分离到2株红曲霉,经菌落及显微形态初步鉴定为烟色红曲霉和橙色红曲霉。采用对硝基苯酚法对菌株产酯化酶进行分析,结果表明,在固态发酵条件下,培养基水分(水分/高粱)为1.4、35℃、pH6.5、发酵时间为8 d时,酯化酶酶活较高,达到2.46 U。     

贝酵母ADR1基因的克隆和生物信息学分析

酿酒酵母ADR1基因是编码过氧化物酶蛋白质转录的正向调节基因,对乙醇代谢有正向调节作用。本文采用PCR技术首次在贝酵母基因组DNA中对ADR1基因序列进行全长克隆,利用在线分析工具ProtParam、ProtScale、TMHMM、PredictProtein、Swiss-Model等软件对其编码蛋白质的基本理化性质进行分析,同时预测了该基因所编码蛋白质的二级结构和三级结构。结果表明:该核苷酸序列含有一个长3960 bp的开放阅读框,可编码1319个氨基酸。编码的蛋白质为在细胞核中行使调控功能的亲水蛋白,含有17个丝氨酸(S)激酶潜在磷酸化位点、四个coil区和2个锌指结构域,与酿酒酵母ADR1基因所编码的蛋白质结构和性质极为相似,可初步认为贝酵母ADR1基因是乙醇脱氢酶的调控基因。     

克氏原螯虾虾青蛋白A2基因克隆、组织分布及原核表达

虾青蛋白对甲壳类水产品色泽的形成和调控具有重要作用。为探究克氏原螯虾虾青蛋白A2(PcCRA2)的基因结构及原核表达,作者通过基因克隆获得PcCRA2基因编码序列（cra2）,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测cra2基因在克氏原螯虾9种组织中的表达模式,并以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,进行PcCRA2异源重组表达。结果表明,克氏原螯虾cra2基因cDNA全长573 bp,编码190个氨基酸。生物信息学分析显示,虾青蛋白A2相对分子质量为21 158.9,理论等电点为5.59。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾cra2编码蛋白质序列与红螯螯虾相似度最高,为91.58%。RT-qPCR结果显示,cra2在所检组织中均有表达,在表皮的表达量最高（P<0.05）。构建了pET28a-cra2原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。其最佳诱导表达条件为：接种4 h后加入0.5 mmol/L IPTG于30℃诱导6 h;UV-vis结果表明重组蛋白质能与虾青素特异性结合,最大吸收峰为505 nm。该研究结果为进一步研究虾青蛋白质的生物功能奠定基础。     

清香型小曲白酒生产中红曲霉的分离及发酵特性研究

研究采用培养组学首次从清香型小曲白酒绿衣观音土曲和酒醅中分离出9株红曲霉,经形态学和分子生物学分析鉴定为7株紫色红曲霉和2株红色红曲霉。进一步通过耐受性实验发现,该批红曲霉最适pH值为4～5,最低可耐受p H值为3,最高可耐受乙醇浓度为25%vol,以及最适温度为30～35℃。同时,对9株红曲霉制成的红曲米糖化酶活、蛋白酶活和酯化力进行了检测,结果发现红曲T4蛋白酶活最高,红曲M2糖化酶活最高,红曲T2的酯化力最高。本研究阐明了清香型小曲白酒生产中红曲霉种类及发酵特性信息,为下步红曲霉的应用提供了理论依据。     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。