新型食品包装材料PHB的生物合成

聚-3-羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate, PHB)作为一种新的塑料替代品,具有良好的生物相容性和生物可降解性,目前已成为食品包装领域研究的热点.甲基弯菌(Methylosinus trichosporium) IMV 3011可以利用单碳碳源在非灭菌条件下胞内合成PHB.为获得能够利用低成本碳源高产PHB的菌种,对甲基弯菌IMV 3011积累PHB的能力进行了研究.对碳源的种类、供给形式、供给量和培养基组分的研究结果表明.甲基弯菌对甲醇的耐受能力提高后,加入0.1%甲醇可使甲烷中的该类菌种达到较高的生长密度(2.5g/L);通过对第1阶段培养期的选择和第2阶段培养基组分(NH+4、NO-3、H2PO-4、Mg2+、Cu2+、Fe3+)的调整,有效缓解了第2阶段的优化培养基中细胞生长与PHB积累的矛盾,实现了两个阶段细胞量的增长及第2阶段单位细胞PHB积累量的增长,提高了PHB的含量(34.9%)与产量(0.6g/L);通过对各种条件的研究,发现相对分子质量的可调控性.PHB相对分子质量在106以上.     

产聚β-羟基丁酸酯(PHB)菌种的筛选及16SrDNA鉴定

采用尼罗蓝荧光法结合苏丹黑染色法从污水中初筛获得产聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的菌种,超声波破壁处理后采用氯仿法抽提PHB,最终通过气相色谱和紫外可见分光光度计确定了一株高产PHB菌株PK3,PHB产量为0.732g/L。经形态观察、16SrDNA序列分析,初步鉴定PK3为假单胞菌属(Pseudomonas koreensis)。     

不同来源红缘拟层孔菌粗多糖的抗氧化活性

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、2,2’-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS）阳离子自由基、羟自由基清除实验和铁氰化钾还原法,对3 种不同产地（吉林、黑龙江、云南）红缘拟层孔菌子实体（Fomitopsis pinicola fruiting body,分别记为JFPF、HFPF、YFPF）、红缘拟层孔菌菌丝体（Fomitopsis pinicola mycelium,FPM）及其发酵液（Fomitopsis pinicola fermentation broth,FPFB）粗多糖的体外抗氧化活性进行对比研究;并采用紫外线和H2O2氧化损伤酵母细胞保护实验模型,评价上述5 种粗多糖对氧化损伤酵母细胞的保护作用。结果表明：这5 种红缘拟层孔菌粗多糖均表现出不同程度的体外抗氧化活性,并均能明显提高氧化损伤酵母细胞的存活率,且呈一定的剂量依赖效应;其中,YFPF粗多糖对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基的清除能力及还原能力在5 种粗多糖中较强;在质量浓度为5 mg/mL时,其对3 种自由基的清除率分别为78.78%、99.24%、64.38%,还原能力为0.84。FPM粗多糖对氧化损伤酵母细胞保护作用最强,可明显提高氧化损伤酵母细胞的存活率,当其质量浓度为20 mg/mL时,紫外和H2O2氧化损伤酵母细胞的存活率分别为75.48%、48.38%。因此,不同来源红缘拟层孔菌粗多糖的抗氧化活性存在差异,这为红缘拟层孔菌的开发利用提供理论依据。     

活性污泥中1株产PHB丝状细菌的分离与鉴定

从污水处理厂等活性污泥样品中分离到了19株丝状细菌,通过苏丹黑染色法和紫外吸收光谱扫描技术证明这些丝状细菌能够在菌体内积累聚β-羟基丁酸(PHB)。采用氯仿乙醇法提取PHB,并采用紫外吸收法进行定量测定,筛选出1株高产PHB丝状细菌HY10,细胞PHB含量为(37.24±0.74)%,PHB产量为1.15±0.06 g/L。综合该菌株的菌落形态和16S rDNA序列(GenBank No.JQ353768)分析结果将HY10菌株鉴定为假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。     

六氢β-酸对李斯特氏菌抑制作用的研究

本文研究了六氢β-酸对李斯特氏菌的抑菌活性影响。结果表明:5×10~(-6)g/ml的六氢β-酸对李斯特氏菌有明显的抑制作用。温度及酸碱处理对六氢β-酸的抑菌活性影响较少,但使用环境的pH值对六氢β-酸的抑菌作用有显著影响。肉制品保藏实验表明:六氢β-酸的防腐保鲜能力明显优于目前常用的食品防腐剂乳酸链球菌素(Nisin)、山梨酸钾及苯甲酸。     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇aldH基因缺失菌株的构建

该研究利用λRed重组技术对克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）中的乙醛脱氢酶（aldH）基因进行敲除,成功构建缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH,与原始菌株相比,缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1,3-丙二醇产量由原来的78.83 g/L增长至82.55 g/L,提高了4.72.%;甘油转化率由60.64%增长至63.50%,提高了2.86%。缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH 50 L发酵罐小试试验中,1,3-丙二醇的产量为78.13 g/L,乙醇产量为0.50 g/L。     

响应面法优化假单胞菌koreensis产聚-β-羟基丁酸酯的发酵工艺参数

聚-β-羟基丁酸酯(PHB)作为一种完全可降解生物塑料,有望替代传统塑料应用于食品包装、农业和医药等领域,但高昂的生产成本制约着PHB更广泛的应用。本文在以前培养基配方优化结果的基础上,对发酵工艺参数进行响应面优化,确定最佳发酵工艺参数,进一步提高PHB产量。首先,通过单因素试验,确定了转速、初始pH值、接种量和温度的水平范围;然后,以单因素试验结果为基础,采用Design Expert8.0软件设计Box-Behnken四因素三水平、5个中心点、共29组的响应面试验,得到拟合回归方程;最后,通过软件分析确定了假单胞菌koreensis发酵产PHB的最佳工艺参数。结果表明:转速170.91r/min、初始pH值7.64、接种量6.21%和温度32.15℃,PHB产量达4.42g/L,为优化前的1.38倍,效果显著。     

自筛β-葡萄糖苷酶高产菌-N_1制备大豆异黄酮苷元的研究

目的:探索一种用自筛的β-葡萄糖苷酶高产菌-N1制备大豆异黄酮苷元的方法。方法:应用酶学研究常规方法在实验室条件下,用自筛的β-葡萄糖苷酶高产菌-N1获得β-葡萄糖苷酶液,探索制备大豆异黄酮苷元的工艺。结果:实验室制备的大豆异黄酮苷元样品纯度为91.33%,收率为11.44%。大豆异黄酮粗品经处理后,苷的数量减少,大豆苷和黄豆黄苷从28.21%降低到22.93%,染料木苷从8.24%降低到5.67%。苷元的数量明显的增加,大豆苷元从0.04%增加至0.05%,黄豆黄素从的0.003%增加至0.09%,染料木素从0.006%增加至0.07%。结论:研究表明以自筛菌-N1作为酶促反应制备大豆异黄酮苷元的β-葡萄糖苷酶产生菌完全可行。大豆异黄酮粗品经酶液处理后,苷元的数量有明显的增加,尤其是黄豆黄素和染料木素,分别增加了30倍和11.67倍。为进一步研究奠定了基础。     

红茶菌中醋酸菌和酵母菌的分离鉴定及其相互作用

采用涂布平板法分离红茶菌中的醋酸菌和酵母菌，然后将分离得到的醋酸菌和酵母菌按照一定比例分别进行共培养，比较细菌纤维素的产量差别。结果表明，从红茶菌中分离出1株醋酸菌，经鉴定为居间驹形杆菌（Komagataeibacter intermedius）；3株酵母菌，经鉴定分别为布鲁塞尔酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）、二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）和核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola），其中布鲁塞尔酒香酵母为优势酵母。当居间驹形杆菌与布鲁塞尔酒香酵母以1∶100的比例共培养时，产生的细菌纤维素最多达4.70 g/L；当二孢接合酵母和核果梅奇酵母以相同比例分别与居间驹形杆菌共培养时产生的细菌纤维素分别为3.59 g/L（高于对照组）和1.14 g/L（低于对照组）。由此可知，布鲁塞尔酒香酵母和Z. bisporus均能够促进居间驹形杆菌产细菌纤维素，而核果梅奇酵母对居间驹形杆菌没有明显的促进作用。     

碳源对克氏菌合成PTT原料PDO的影响及对DhaB的表达调控

为提高1,3-丙二醇（PDO）产量,加快聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）的产业化应用。考察了不同碳源对克雷伯氏菌合成PDO过程中碳流的影响和对关键酶DhaB的表达调控。结果表明,克雷伯氏菌不能直接利用葡萄糖合成PDO;以甘油为单一碳源时,PDO的产量仅为9 g/L,同时细胞生长受到一定抑制;而在甘油为底物的情况下,添加5 g/L的葡萄糖能够使菌体生物量提高66.7%、dhaB的转录上调20%、DhaB酶活提高64%,同时PDO产量提高1.5倍。上述结果表明混合碳源策略能够激活克雷伯氏菌PDO合成途径关键酶DhaB的表达,提高PDO的产量。     

北极海洋红球菌B7740（Rhodococcus sp.）产类胡萝卜素和类异戊二烯醌的抗氧化、抗增殖活性

本实验旨在研究来自北极海洋红球菌B7740类胡萝卜素和类异戊二烯醌提取物（B7CIQE）的体外抗氧 化活性（通过β-胡萝卜素漂白测定、脂质和蛋白质氧化抑制实验、DNA氧化断裂抑制实验）、抗增殖活性（通过 抗人肝癌细胞HepG2和人口腔癌细胞KB增殖实验）和细胞内抗氧化效果。实验中使用日常饮食常见高等植物来 源类胡萝卜素（β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素）作为对照组,评价B7CIQE的生物活性：β-胡萝卜素氧化抑制 率为B7CIQE（70.20%）＞2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（66.70%）＞表没食子儿茶素没食子酸酯（17.80%）＞番茄 红素（1.90%）;油脂开始氧化的温度顺序为B7CIQE（175 ℃）＞β-胡萝卜素（165 ℃）＞叶黄素（162 ℃）＞ 番茄红素（160 ℃）;蛋白质氧化抑制率为B7CIQE（25.75%）＞β-胡萝卜素（24.97%）＞叶黄素（17.94%）＞ 番茄红素（10.40%）;HepG2细胞抗增殖实验半最大效应浓度为叶黄素（20.86 μg/mL）＜β-胡萝卜素 （124.88 μg/mL）＜B7CIQE（126.34 μg/mL）＜番茄红素（139.24 μg/mL）;KB细胞抗增殖实验半最大效应浓度为 B7CIQE（25.14 μg/mL）＜叶黄素（64.29 μg/mL）＜番茄红素（69.87 μg/mL）＜β-胡萝卜素（149.16 μg/mL）。结 果表明,与植物源类胡萝卜素相比,B7CIQE具有相对更优异的抗氧化和抗增殖活性。     

易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率

对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株。突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH 8.5 Tris-HCl为缓冲液,用900 mmol/L L-异亮氨酸在30℃下进行催化反应21～24 h,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102 g/L,底物转化率达到87%。与对照菌相比,α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13%,热稳定性提高了36.7%。     

氮源对裂褶菌产裂褶多糖和β-1,3-葡聚糖酶的影响

本论文初步探讨了利用裂褶菌发酵体系所产的内切β-1,3-葡聚糖酶对发酵产生的裂褶多糖进行适度酶解,以获得分子量适中溶解度较好的裂褶多糖的可能性。以裂褶多糖产量和β-1,3-葡聚糖内切酶和总酶活为考察指标,采用刚果红琼脂染色法和摇瓶培养,从四株裂褶菌GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1中筛选出多糖产量和酶活都相对较高的菌株GIM5.43,多糖产量和酶活分别为2.29g/L与0.28 U/m L。在摇瓶中考察了氮源及其添加方式对裂褶菌菌体生长、裂褶多糖产率、β-1,3-葡聚糖酶的酶活及其影响规律。结果表明:菌体生长及其分泌胞外多糖和葡聚糖酶的最适酵母浸膏和氯化铵的添加时间和添加量是不同的。为了保证多糖产率,采用分批补加策略,初始酵母浸膏浓度1.00 g/L,发酵第6 d补加0.10 g/L酵母浸膏,多糖产量为4.16 g/L,比未优化提高了61.24%,总酶活为0.34 U/m L,提高了142.86%。     

黑曲霉孢子粉粗提物对青枯雷尔式菌的抑菌机制初探

以黑曲霉（Aspergillus niger）孢子粉作为原料,对其粗提物进行分离,以青枯雷尔式菌（Rastonia solanacearum）为指示菌,对抑菌活性进行监测,并利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析其活性成分。通过测定电导率、核酸蛋白泄露、总蛋白以及活性氧（ROS）等指标的变化分析黑曲霉抑菌机制。结果显示,黑曲霉粗提物洗脱液S5对青枯雷尔式菌具有良好的抑菌效果,抑菌率可达90.87%;GC-MS检测结果显示,其主要成分为油酸（26.52%）、亚油酸甲酯（14.46%）、油酸甲酯（11.10%）、棕榈酸（10.50%）、油酸乙酯（7.36%）、亚油酸乙酯（6.88%）等;粗提物主要通过影响细胞膜完整性、损伤细胞结构、抑制细胞蛋白质合成及能量代谢等方面达到抑制菌株Q11-2的效果。     

罗汉果内生菌的分离及α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选

该研究从广西龙胜县的罗汉果植株根中分离内生菌,并采用打洞法和Bernfeld法从中筛选出对α-淀粉酶具有抑制活性的菌株进行鉴定,进一步采用有机溶剂萃取发酵液后进行活性部位追踪。结果表明,从罗汉果根中分离得到10株内生菌,并从中筛选到2株α-淀粉酶抑制活性较高的菌株PD-3（42.51%）和PD-4（56.29%）;两菌株的α-淀粉酶抑制活性物质均来自发酵液,发酵液经萃取后,菌株PD-3和PD-4抑制活性最高的萃取相分别为正丁醇相和乙酸乙酯相,对α-淀粉酶的抑制率分别为74.19%和88.46%,较阿卡波糖的抑制率（45.17%）高;菌株PD-3的正丁醇相含有多糖、黄酮等化学成分,菌株PD-4的乙酸乙酯相含有糖类、酚和醌等化学成分;两株菌株经形态观察均初步鉴定为青霉属（Penicillium）,表明罗汉果内生真菌具有产α-淀粉酶抑制剂的潜力。     

酒花内生菌转化β-月桂烯合成芳樟醇和香叶醇

利用微生物催化酒花油中β-月桂烯生成芳樟醇和香叶醇是一种理想的生物转化途径，有利于提升酒花β-月桂烯的经济价值。该文从酒花雌花果中筛选出一株内生菌Z1，通过菌落形态观察、生理生化以及16S rDNA序列分析鉴定该菌株；研究其催化β-月桂烯合成芳樟醇和香叶醇的条件，并用于转化酒花油的β-月桂烯。结果表明，酒花内生菌Z1与菠萝泛菌（Pantoea ananatis）的菌落形态和生理生化特点相同，16S rDNA的同源性为98.2%，命名为Pantoea ananatis Z1。将该菌株于葡萄糖蛋白胨酵母麦芽粉（glucose peotone yeast and malt，GPYM）培养基中培养，转化14.1 g/L的β-月桂烯，产物芳樟醇和香叶醇浓度分别为0.89 mg/L和1.09 mg/L。对含有1.41 g/L β-月桂烯的酒花油进行转化，芳樟醇和香叶醇生成量达0.52 g/L和0.09 g/L，转化率分别提高了10 248倍和1 483倍。研究表明，P.ananatis Z1可将酒花油中的β-月桂烯一次性转化为芳樟醇和香叶醇，初步分析认为酒花油中β-月桂烯和芳樟醇的共同存在促进P.ananatis Z1对β-月桂烯转化。     

费氏丙酸菌HZ-P-35细胞高密度培养转化亚油酸生成共轭亚油酸

对费氏丙酸杆菌HZ-P-35高密度培养转化亚油酸生成共轭亚油酸进行了研究.共轭亚油酸(CLA)的测定以十七碳烯酸作内标物经甲酯化后采用气相色谱法测定.采用间歇培养、pH-stat培养、间歇补料培养和连续补料培养四种培养方式进行细胞高密度培养实验.pH-stat培养、间歇补料和连续补料都大大地提高了菌体密度和CLA产量.相对于间歇培养,采用pH-star培养模式丙酸菌细胞干重提高1.5倍,达到1.2g/L;而间歇补料培养和连续补料培养的细胞干重分别提高3.4倍和2.97倍,分别达到2.72 g/L和2.38 g/L.pH-stat培养模式CLA产量是间歇培养的1.06倍,达到114.50μg/mL,间歇补料培养CLA产量是间歇补料培养的1.17倍,达到127.34μg/mL,连续补料培养模式CLA的产量是间歇培养CLA量的1.29倍,达到139.67μg/mL.试验结果表明,间歇补料培养较有利于细胞高密度培养,细胞产率达到9.074 mg/(L·h),而连续补料培养较有利于CLA产生.     

耐热β-葡聚糖酶产生菌AS35产酶条件的研究

本试验对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS35产β-葡聚糖酶的发酵条件进行优化研究。单因素实验结果表明:该菌产β-葡聚糖酶的最佳碳源为麦糟粉,添加量为3.0%(w/v),最佳麦糟粉颗粒直径为0.5mm左右;最佳氮源为蛋白胨,添加量为0.8%(w/v);最佳培养基初始pH为7.0;最佳摇瓶装液量为50mL/250mL三角瓶;最佳发酵温度为36℃。在上述优化条件下,以接种量10%(v/v)接种菌龄18h的种子于发酵培养基中,200r/min摇床培养60h,β-葡聚糖酶酶活达到32.5U/mL。同时,耐热性实验表明,该酶最适反应温度为65℃。     

耐热β-半乳糖苷酶重组菌WB600/pMA5-bgaB发酵条件的研究

耐热β-半乳糖苷酶相比酵母来源的中温乳糖酶用于低乳糖牛奶的生产具有潜在的优越性。在已将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆入枯草芽孢杆菌得到重组菌WB600/pMA5-bgaB后,对此重组菌的发酵条件进行了研究。重组菌WB600/pMA5-bgaB在发酵过程中具有良好的遗传稳定性,可溶性淀粉和胰蛋白胨是重组菌生长和酶活表达的适合碳源和氮源。WB600/pMA5-bgaB适宜的摇瓶培养条件为接种量3%～5%,装液量30～50/250 mL(三角瓶),起始pH7.0,摇床转速220r/min。在7L反应器中进行分批发酵,研究表明,pH调控和溶氧控制对提高工程菌发酵产酶具有明显帮助,pH控制在7.0,溶氧控制在50%可提高发酵酶活;补料培养后菌体密度OD_(600)可达到47,酶活达到37.5U/mL,比在初始条件下提高了10倍。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶培养基组成的优化研究

采用恒温摇床培养法培养裂褶菌,研究了裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶培养基组成中的碳源、氮源及各种无机盐的单因素参数,并采用四因素三水平正交实验对主要影响因素进行分析,从而确定最佳的产酶培养基配方为:葡萄糖2%,牛肉膏0.3%,NH4Cl0.1%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%。