丁酸梭菌的益生特性及其活性代谢产物

为研究丁酸梭菌的益生特性及其胞外代谢产物，通过体外模拟试验评估其益生特性，包括对模拟消化道、胆盐耐受性、疏水性和自聚集性，以及发酵液的抑菌活性，并采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（ultrahigh performance liquid chromatography and four-stage pole electrostatic field orbital trap mass spectrometry，UHPLC-QEMS）技术对其胞外代谢产物进行非靶向代谢组学分析。结果表明，丁酸梭菌对模拟消化道环境和胆盐具有较强的耐受性，经模拟消化道环境处理2.5 h，其存活率仍高达90%以上，可耐受浓度低于0.4%的胆盐；其疏水率与12 h 的自聚集率均在30%以上；其发酵上清液对福氏志贺氏菌有显著抑菌作用（P＜0.05），对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌有一定抑菌作用，对金黄色葡萄球菌无抑菌作用。丁酸梭菌胞外代谢产物主要有12 种有机酸类、7 种氨基酸类、5 种核苷类和7 种其他物质，部分活性代谢物具有一定的益生作用和应用于食品生产的潜力。     

几种丁酸梭菌的性能研究

选择7种丁酸梭菌（编号为D1～D7）,分别从贮存稳定性、耐热特性、人工胃液耐受性、抗生素抗性以及丁酸产量等方面对丁酸梭菌特性进行了比较研究。结果显示,7种丁酸梭菌室温及-20 ℃存放240 d后,存活率分别为50.00%和59.00%,高于其他菌粉;在70～100 ℃热处理10 min后,菌株D2存活率均为100.00%,110 ℃处理10 min存活率为48.49%,120 ℃处理10 min存活率为37.00%,耐热性最好;耐人工胃液试验中,pH 2.0处理2 h后,菌株D2耐受性最好,存活率为100.00%;抗生素抗性试验中,7种丁酸梭菌均对链霉素、甲氧嘧啶表现出抗性。此外,菌株D2在发酵24 h和48 h后,其丁酸含量分别为8.31 g/L和8.26 g/L,含量显著高于其他菌粉（P＜0.05）。7种菌粉相比较,菌株D2性能更为优良,为丁酸梭菌的贮存及性能评价提供参考依据。     

丁酸梭菌的生物学特性分析及发酵培养基优化

该研究以四株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）为出发菌,通过测定4株菌产酸性能、产酶活力、抑菌性能和抗逆性等,筛选生物学性能最优的丁酸梭菌,并以活菌数为响应值,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面试验对其发酵培养基组成进行优化。结果表明,筛选得到生物学性能最优的菌株为丁酸梭菌BLCC1-0022,其最优发酵培养基组成为：可溶性淀粉2.42%、蛋白胨3.27%、牛肉浸膏3.31%、CaCO3 2.47%、MgSO4·7H2O 0.025%、MnSO4·H2O 0.025%,pH 7.0±0.2。在此最优培养基组成下,按照2%（V/V）接种量接种丁酸梭菌发酵液,37 ℃静置培养24 h,丁酸梭菌BLCC1-0022活菌数达6.721×108 CFU/mL,芽孢率为98.21%,与原培养基相比,分别提高了3.22倍、17%。     

丁酸梭菌的筛选及其胞外多糖抗氧化性的研究

通过改良丁酸梭菌筛选培养基,提高了丁酸梭菌的筛选效率,获得1株高产胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)的丁酸梭菌RO-07。进一步研究丁酸梭菌RO-07的肠道耐受性和抗生素敏感性,结果表明,该菌株对质量浓度为0.5～4 g/L的牛胆盐具有良好的耐受性,对人工胃液和人工肠液有较好的耐受性,对氨基糖苷类抗生素的耐药性较强。对丁酸梭菌EPS的抗氧化特性研究表明,终质量浓度为0.33 mg/mL的EPS对·OH的清除活性达到75.2%,对O~-_2·清除能力达到95%,具有很强的抗氧化性。     

应用pH-shift控制策略制备丁酸新工艺及其优化

以嗜热丁酸梭菌为生产菌株,研究不同pH(6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0)条件对嗜热丁酸梭菌生长和产酸的影响。基于不同pH条件下试验结果的分析比较,拟采用pH-shift控制策略,运用发酵法制备丁酸,并探索最优工艺条件。通过单因素试验和正交优化试验确定了最优发酵工艺条件为:0~20 h将pH控制在6.8,而后将pH调低至6.2并保持到发酵结束,发酵温度为55℃,发酵总时间为50 h,以6 mol/L NaOH溶液为中和剂,采用自动流加方式。优化后的发酵工艺能有效提高丁酸产量,通过应用pH-shift控制策略,丁酸产量达16.12 g/L,与固定pH条件下发酵最好结果相比提高35.69%。该试验结果表明采用pH-shift控制策略的新工艺可有效提高丁酸发酵过程的效率。     

乙酸和乙醇对酪丁酸梭菌产丁酸的影响

酪丁酸梭菌为厌氧菌，主要产物为丁酸，丁酸在食品中作为添加剂被广泛使用。通过对酪丁酸梭菌发酵产酸能力进行初步探究，发现在一定浓度范围内添加外源乙醇，能够使酪丁酸梭菌W-1菌株产丁酸能力得到提升，丁酸产量达到顶峰时，乙醇添加量为1%，产量为2.9673 g/L，增加率为38.87%。而外添加乙酸的添加则并不能使丁酸产量得到提升。     

窖泥中高产丁酸梭菌的筛选、鉴定及其生长耐受性研究

从浓香型白酒窖泥中通过传统微生物分离手段筛选高产丁酸的梭菌,并对分离菌株进行形态学观察、分子生物学鉴定及生长耐受性分析研究。结果表明,通过发酵产物检测获得两株高产丁酸菌株,编号为AB2RH027和AB2RH033,经过菌落观察、革兰氏染色及分子生物学鉴定两株菌均为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。通过耐受性实验,确定菌株AB2RH027最适生长pH值为8,最适生长温度为40 ℃,酒精耐受性为15%vol,发酵24 h丁酸产量为5.29 g/L;菌株AB2RH033最适生长pH值为8,最适生长温度为35 ℃,酒精耐受性为18%vol,发酵24 h丁酸产量为5.23 g/L。该研究筛选得到的两株高产丁酸的菌株在白酒品质提升方面具有一定应用价值。     

酸适应海德尔堡沙门氏菌对环境胁迫耐受性分析

目的：研究海德尔堡沙门氏菌（Salmonella heidelberg）低pH值酸适应性及酸适应对细胞其他胁迫环境耐受性的影响。方法：海德尔堡沙门氏菌在pH 5.5酸性培养基中生长2 h诱导酸适应性,以pH 3.0酸胁迫培养基及不同温度、NaCl、胆盐、消毒剂环境的存活率评价其耐受性。结果：pH 5.5酸适应2 h后,海德尔堡沙门氏菌在pH 3.0酸胁迫环境的存活率大幅提高。低pH值酸适应也使海德尔堡沙门氏菌在45、50 ℃高温条件下的存活率显著提高,对4 ℃冷藏环境的耐受性显著低于非酸处理菌株,但对－20 ℃冷冻环境的生存无影响。酸适应海德尔堡沙门氏菌对高渗、胆盐胁迫也表现良好的耐受性,5～10 g/100 mL NaCl溶液处理1 h,酸适应海德尔堡沙门氏菌的存活率大于60%,在1～10 g/100 mL胆盐溶液的存活率比对照组高3.8 倍。海德尔堡沙门氏菌酸适应性也使其对消毒剂的敏感性发生变化,酸适应性海德尔堡沙门氏菌在10～25 mmol/L H2O2溶液的存活率显著高于对照菌株,最高达3.1 倍;但对NaClO、乙醇消毒剂的耐受性显著降低,高质量浓度下二者无显著差异。结论：海德尔堡沙门氏菌在低pH值酸性条件生长一段时间会诱导产生酸适应性,还会协同提高其对高温、高渗、胆盐、H2O2胁迫环境的交叉抗性;但对4、－20 ℃低温、NaClO、乙醇等杀菌、保藏措施敏感性提高。     

产乳酸芽孢杆菌DU-106益生特性的研究

以产乳酸芽孢杆菌（Bacillus sp.）DU-106为研究对象,对其益生特性进行研究。测定菌株DU-106发酵过程中的生长曲线、产酸曲线、高胆盐耐受性、模拟胃肠液耐受性、酸性pH耐受性和抗生素敏感性。结果表明,菌株DU-106在发酵36 h后达到稳定的生长期和较高的产酸量,产酸约1.7 g/L;经过0.3%和0.6%浓度的胆盐处理4 h后,存活率分别为91.8%和73.9%;经过4 h模拟胃液和24 h模拟肠液处理后存活率分别为66.5%和71.7%;在pH值为2的环境中经过1 h和3 h培养后存活率分别为58.8%和83.3%;对庆大霉素、四环素、红霉素、克林霉素、万古霉素、诺氟沙星、环丙沙星、加替沙星、磷霉素、亚胺培南等11种常用的抗生素敏感。菌株DU-106具有良好的体外益生性能,可作为益生菌进一步开发。     

顶空-气相色谱法测定丁酸梭菌发酵液中 短链脂肪酸含量

短链脂肪酸是丁酸梭菌生长代谢过程中的重要产物,是肠道内发生益生作用的主要物质之一。利用顶空-气相色谱(HS-GC)内标法测定短链脂肪酸,对该方法进行了方法学验证,并测定了丁酸梭菌在48 h发酵过程中短链脂肪酸含量的变化。结果表明:采用HS-GC可以很好地将各短链脂肪酸分离,且选用的内标物2-乙基丁酸与待测组分之间分离度较好;各短链脂肪酸标准品在0. 1～20. 0 mmol/L范围内,线性相关系数均大于0. 999,检出限为0. 01～0. 17 mmol/L,定量限为0. 02～0. 53 mmol/L,3 d内稳定性良好,样品加标回收率在88. 90%～108. 71%之间,符合测定要求;发酵液中检测到乙酸和丁酸两种短链脂肪酸,且含量随发酵时间延长逐渐增加,在40～48 h期间,乙酸和丁酸含量分别稳定在11. 9 mmol/L和14. 1 mmol/L左右。该方法无需复杂的前处理操作,准确度和精密度均符合要求,总分析时间较短,适用于丁酸梭菌发酵液中短链脂肪酸的快速检测。     

Screening of commercial meat starter cultures at low pH and in the presence of bile salts for potential probiotic use

The survival of lactic acid bacterial strains from eight meat starter cultures under conditions similar to those in the gastrointestinal tract was determined. The conditions in stomach were simulated by using pH 1-5 phosphate-buffered saline. The conditions in small intestine were simulated by using MRS broth over a pH range 4-7 and two bile salt concentrations (0.15% and 0.30%). The survival capacity at pH 3 was strain dependent. 0.30% bile salts were critical for screening bile salt tolerant strains at pH 6. Strains of Lactobacillus sake (RM10) and Pediococcus acidilactici (P2) had the best survival capacities under acidic conditions and at the higher concentration of bile salts.     

产ACE抑制肽菌株的筛选及其在模拟消化道环境中的活性分析

为了筛选出对血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性较高并且具有较强的耐酸耐胆盐和耐盐的乳酸菌,对实验室保存的27株乳酸菌进行了产酸能力、蛋白水解活力、ACE抑制活性、模拟胃肠道消化及酸、胆盐和盐耐受性的测定。结果显示,菌株M3的ACE抑制率可达71.94%±1.39%,具有较好的蛋白水解活力和产酸能力,蛋白水解活力为（86.66±3.51）μg/mL亮氨酸,滴定酸度为（71.67±2.86）°T。菌株M3经人工胃肠液分别处理3 h后,ACE抑制率为74.96%±1.73%;在pH3的环境中3 h,耐受性为14.34%±1.21%,活菌数能达到7 lg CFU mL?1以上;在含有0.3%胆盐的培养基中3 h,耐受性为37.50%±2.47%;在含有4% NaCl的培养基中24 h,耐受性为37.32%±1.84%。该菌经16S rDNA鉴定为Lactobacillus (Lb.) paracasei subsp. paracasei M3。因此,菌株Lb. paracasei subsp. paracasei M3可用作发酵牛乳富产ACE抑制肽且能耐受消化道环境具有益生菌潜力的菌株。     

费氏丙酸杆菌生物学特性及与5株益生菌拮抗性试验研究

为了评价费氏丙酸杆菌的益生特性,费氏丙酸杆菌活化后,划线和镜检观察其形态特征,然后利用体外共培养法测定费氏丙酸杆菌对3种致病菌的抑制效果,同时利用平板计数法研究费氏丙酸杆菌的耐酸性、耐胆盐和耐高温等生物学特性,以及5株益生菌拮抗性试验。结果表明,费氏丙酸杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌没有显著的抑制作用,而对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显（P＜0.01）;其在pH值为2.0条件下维持3 h,活菌数降低一个数量级;在胆盐含量为0.30%条件下维持6 h,存活率为18.67%;在60 ℃下处理20 min,存活率为12%,因此费氏丙酸杆菌具有一定的耐酸、耐高温能力以及很强的耐胆盐活性。除枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌有拮抗作用外,其余菌株间均没有拮抗作用。     

4株乳酸菌对模拟胃肠环境的耐受性及生长特性研究

对4株来源于自然发酵肉制品中的乳酸菌进行耐酸耐胆盐性能的测定,选取在pH3.0和含0.3 g/100 mL胆盐的MRS培养基中存活率均超过50%的2株菌（M12、M23）,进一步研究其在模拟胃肠液中的耐受性及MRS培养基中的生长特性。结果表明,这2株乳酸菌对人工模拟胃肠道环境有较好的耐受性,经过人工模拟胃液处理2 h后,存活率均＞50%,经人工模拟肠液处理10 h后仍可存活;这2株菌具有较强的增殖及产酸能力,24 h内均已进入稳定生长期,随着菌体数目的增加,培养基pH值快速降低,在肉制品的发酵温度范围内均能较好地生长。因此,这2株菌可作为潜在的益生菌菌株应用于肉制品的发酵。     

鼠李糖乳杆菌耐酸及胆盐能力研究

本实验对来源于婴儿粪便鼠李糖乳杆菌进行耐酸、耐胆盐能力表征及模拟胃液和模拟肠液实验。结果获得鼠李糖乳杆菌菌株B在pH1.8条件下,维持2h,活菌数达到107CFU/ml以上;在pH值为2.2以上的培养基中生长良好,而且随着时间的延长菌株的数量增加。在胆盐浓度在0.5%以下的MRS-broth培养基中鼠李糖乳杆菌B菌株维持4h,活菌数均达到108CFU/ml以上,而且随着时间的延长活菌数均有所增加。模拟胃液和模拟肠液实验结果表明该菌株能够有效通过胃环境,并能在肠道中繁殖。结果可见,鼠李糖乳杆菌B具有较强的酸的胆盐的耐受能力,符合微生态制剂和乳酸菌发酵功能食品菌种的要求。