耐辐射奇球菌DR_2327和DR_2328基因克隆及功能分析

通过生物信息学分析耐辐射奇球菌DR_2327和DR_2328基因及编码蛋白的基本性质,利用PCR方法克隆DR_2327和DR_2328的全基因,连接至p GEM-T载体上,转化至大肠杆菌JM109中,并进行双酶切鉴定。生物信息学分析结果表明,DR_2327和DR_2328基因位于同一操纵子中,且DR_2328蛋白具有组氨酸激酶活性,DR_2327蛋白具有反应调节子功能,提示两者很可能组成一对双组分系统。体外实验表明,DR_2327和DR_2328基因的外源表达在一定程度上提高了大肠杆菌对紫外辐照和H2O2的耐受能力。     

耐辐射奇球菌pprM DNA结合域功能分析预测与基因敲除重组体的构建

通过生物信息学分析发现,pprM基因含有冷休克DNA结合域。利用Overlap PCR方法获得pprM基因DNA结合域缺失的基因片段pprMACSD后,酶切扩增的片段和自杀质粒空载体pkl8mobsacB,并将目的基因片段与自杀质粒载体连接构建重组载体pkl8mobsacB-pprMACSD,将重组子转化大肠杆菌JM109感受态,筛选出阳性克隆,酶切及测序鉴定。成功构建pprMDNA结合域基因敲除重组体,且生物信息学分析预测结果显示pprMDNA结合域与耐辐射奇球菌抗辐射功能相关。     

耐辐射奇球菌的辐射损伤修复机制研究进展

耐辐射奇球菌是地球上目前发现的最耐辐射的生物之一,它对于电离辐射、紫外线、H2O2以及其他一些因素所导致的DNA和蛋白质的损伤都具有极强的耐受与抵抗能力。目前已知耐辐射奇球菌的高效DNA损伤修复能力是其具有超强辐射抗性的关键,但是对于该修复能力的具体作用机制,目前尚未有定论。本工作将就耐辐射奇球菌DNA辐射损伤修复主要机制研究进展作一综述。     

耐辐射球菌PprI蛋白质表达及其纯化的实验研究

为了在大肠杆菌中高效表达耐辐射球菌PprI融合蛋白并进行纯化,本研究以PCMV-HA-pprI质粒为模板,PCR扩增pprI基因全序列,经NcoI和EcoRI双酶切后定向克隆到pET-28a表达载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转入E.coli BL21(DE3)RP.IPTG诱导融合蛋白...     

耐辐射奇球菌对铀的富集性能及其对pH动态调节研究

探索耐辐射奇球菌在不同时间、不同菌剂量、不同初始铀浓度、不同溶液pH下对铀的富集条件以及对铀溶液的pH调节;通过红外光谱和扫描电镜表征其富集机理。结果表明：富集铀的最佳富集时间为60 min、最佳菌剂量为10 mL(当OD₆₀₀为1时的菌液量)、最佳铀初始质量浓度为30 mg/L、最佳pH为5.0;在不同pH的铀溶液中富集后,溶液pH都略有上升;红外光谱仪和扫描电镜结果显示,耐辐射奇球菌富集前后菌体的多个活性官能团和形貌都发生了变化。耐辐射奇球菌对低浓度铀溶液的富集性能较好;对铀溶液pH有调节作用,使富集后的铀溶液pH上升。     

抗增殖蛋白Tob1对人类宫颈癌细胞系HeLa放射敏感性影响的实验研究

为探讨抗增殖蛋白家族成员Tob1(transducer of ErbB2,1)对宫颈癌细胞系HeLa放射敏感性的影响,构建可表达Tob1基因全长的重组质粒pcDNA3.0-Tob1(pc3/Tob1),采用脂质体介导转染入HeLa细胞,经G418筛选出阳性耐抗克隆。通过集落形成实验研究Tob1对HeLa细胞放射敏感性的影响,借助流式细胞术和WesternBlot法检测相关分子机制。结果显示,较之HeLa母细胞和转染"空"质粒pcDNA3.0的HeLa/pc3细胞,转染pc3/Tob1后HeLa细胞放射敏感性明显增加;Tob1蛋白高表达增加了HeLa细胞中由辐射诱导的细胞凋亡,提高了由辐射引起的Bax蛋白的表达,降低了Bcl2蛋白表达。上述结果提示Tob1提高了HeLa细胞对电离辐射的敏感性,其机制可能与其上调Bax蛋白的表达、下调Bcl2蛋白的表达,从而增加由辐射诱导的细胞凋亡有关。     

耐辐射球菌PprI蛋白对急性放射损伤小鼠防护作用的初步研究

研究耐辐射球菌PprI蛋白对哺乳动物急性放射损伤的防护作用,初步探讨其作为一种新的抗辐射蛋白的作用机制。将PprI蛋白或生理盐水注射入小鼠肌肉内,观察辐照后第1、7、14、28天小鼠外周血象以及小鼠骨髓、胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡情况。研究结果表明：与生理盐水注射组相比,PprI蛋白注射组外周血白细胞计数于照后第28天显著增高（p〈0．05）;外周血小板数和淋巴细胞百分率于照后第1、7天显著增高（p〈O．05）;PprI蛋白注射组脾脏淋巴细胞凋亡率在照后第1、7、14天明显降低（p〈0．05）;胸腺淋巴细胞凋亡率于照后第14和28天明显降低（p〈0．05）;骨髓细胞凋亡率在照后第1、14和28天明显降低（p〈0．05）;并且骨髓细胞凋亡率于照后第28天基本恢复正常。上述结果初步表明,耐辐射球菌PprI蛋白对哺乳动物急性放射损伤有着明显的防护作用。     

耐辐射奇球菌pprI和pprA基因在真核细胞293T中的表达

以pGADT-7-pprA、pet28a-pprI载体为模板,构建pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI真核表达载体,脂质体2000介导将两个重组载体共转入293T细胞。双酶切及琼脂糖凝胶电泳显示在4700、1000 bp处与4800、1100 bp处出现目的条带。测序结果显示构建序列与模板序列一致,氨基酸序列100%正确。荧光显微镜下见到红色和绿色荧光;Western blot结果显示在不同检测水平65 kDa及60 kDa大小处有融合蛋白表达。结果提示pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI真核表达载体构建成功,并在离体293T细胞中共同表达蛋白。证明原核基因pprI、pprA能够在真核细胞中共表达,为后续实验验证DR菌高抗性基因pprA、pprI及其产物在辐射调控网络中的相互作用和协同作用、提高真核细胞的辐射抗性提供了研究基础。     

耐辐射基因工程菌Deinococcus radiodurans及其在环境修复中的应用

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是一种革兰氏阳性微球菌,非致病菌,可以应用于放射性核素污染环境的生物修复。由于一般的微生物对辐射非常敏感,因此不能用于既存在放射性核素,又存在有机污染物的复合污染场所。利用物理化学方法清除这类污染,其价格非常昂贵。利用微生物修复这类环境是一种具有活力的替代技术。基因工程手段可以解除微生物固有的一些物理、化学和生理方面的限制。在辐射成为限制微生物生存和发挥其功能的情况下,利用基因改造的Deinococcus radiodurans进行环境修复是一种具有实用潜力的手段。     

增加UHRF1的表达降低乳癌细胞的放射敏感性

为了了解基因UHRF1(ubiquitin-like,containing PHD and RING finger domains,1)基因对乳癌细胞的生长、增殖和辐射敏感性的影响,将全长UHRF1基因的cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,通过脂质体介导转染入乳癌细胞MDA-MB-231,筛选出UHRF1高表达的细胞株.借助生长曲线、集落形成实验,研究基因转染细胞的生长、增殖能力;通过γ射线辐照后的集落形成实验,观察基因转染对细胞辐射敏感性的影响.实验结果显示,与MDA-MB-231母细胞和转染了pcDNA3"空"质粒的MDA-MB-231/pcDNA3细胞相比,转染有UHRF1基因的MDA-MB-231/UHRF1细胞的生长率和克隆形成率都未有明显改变,但细胞的辐射敏感性明显降低,这些结果首次揭示人类UHRF1基因的表达水平并不影响乳癌细胞MDA-MB-231的生长和增殖能力,但可以调节其辐射敏感性,具体机制有待进一步深入研究.     

基于基因表达水平和骨髓功能评估核辐射受照剂量的研究进展

在核事故中,超大剂量核辐射损伤的特点是瞬时发生和不可预测,在受辐射伤员的紧急救治过程中,其实际受照剂量往往是完全未知的,这给伤情的评估和针对性救治方案的制定带来了很大困难。针对这一现状,本文综合介绍了辐射敏感基因的应答性表达改变,可以用来评估伤员曾经接受到的辐射剂量;骨髓免疫显像可以动态评估伤员骨髓造血功能的建立情况;建立辐射致裸小鼠骨髓毁损后骨髓移植救治模型,可为伤员骨髓移植临床前研究奠定基础。     

辐射基因治疗黑色素瘤的实验研究

研究低剂量辐射结合腺病毒(AdCMV)载体介导的p53基因转导对人黑色素瘤A375细胞系基因转移效率和辐射敏感性的影响.用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导入p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的A375细胞系,RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率.用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照.实验结果表明,1 Gy X-射线辐照可较高地增加AdCMV-p53对A375细胞的基因转导效率,转导的外源性野生型p53可在A375(wtp53)细胞中高效表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;单纯转导p53对A375细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应;而转导p53后给予X-射线辐射,当剂量达到4 Gy及其以上时,48h后AdCMV-p53感染组细胞开始出现明显形态改变,克隆存活率明显低于AdCMV-GFP感染组和未感染组,显示存活曲线下移,4Gy时细胞存活率就减少了1个量级.小剂量辐射既可有效增加AdCMV-p53介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用;转导野生型p53的人黑色素瘤A375细胞系显示P53过表达;过表达的P53蛋白虽然对A375细胞无明显生长抑制及凋亡诱导作用,但可明显增加其辐射敏感性.这表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制品用量过大而给病人造成的毒副作用.     

大肠癌细胞辐射敏感相关基因的筛选

应用基因芯片技术初步筛选人大肠癌细胞辐射敏感相关基因.培养2种不同辐射敏感性的人大肠癌细胞LOVO和SW480,收集细胞至少达到107数量级,提取细胞总RNA,采用人全基因组表达谱芯片获得该两株细胞的基因表达谱,分析比较两者之间基因表达的差异.1、LOVO细胞组检出基因16882个,SW480细胞组检出基因17114个.2、在2倍以上差异表达基因中筛选出上调基因908个,下调基因1312个.上调基因中包括Fas基因、NFkB基因等,下调基因中包括Caspas6基因、RAD21基因等,已有研究证明与辐射敏感相关.3、LOVO细胞中高表达的基因主要有CEACAM5、THBS1、SERPINE2、ARL7、HPGD,提示与辐射敏感相关;SW480细胞中高表达的基因主要有SCD、NQ01、LYZ、KRT20、ATP1B1,提示与辐射抵抗有关.1、大肠癌辐射敏感性的预测可以从基因水平来体现.2、表达谱基因芯片技术能快速、灵敏地预测大肠癌辐射敏感性,筛选大肠癌辐射敏感性相关基因.     

辐射联合p53腺病毒重组体转染对肿瘤细胞的影响

以绿色荧光蛋白腺病毒重组体(Replication deficient adenovirus green fluorescence protein recombinant,AdCMV-GFP)为对照,用p53腺病毒重组体(Replication deficient adenovirus p53 recombinant,AdCMV-p53)转染经0、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0Gy γ射线预辐射的HepG2(wtp53)、Hela(wtp53,wtP53低水平表达)和HT-29(mtp53,mtP53过表达)细胞,用克隆形成法检测肿瘤细胞存活,探讨AdCMV-p53转染对p53基因状态与功能不同肿瘤细胞辐射敏感性的影响.结果显示,AdCMV-p53转染不仅明显提高肿瘤细胞辐射敏感性,而且与肿瘤细胞内在p53基因状态与功能有关.     

三种非活性微生物对铀的吸附行为及其受γ辐照的动力学影响

以非活性酿酒酵母菌、耐辐射奇球菌、大肠杆菌为研究对象,利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)、红外光谱(FTIR)等测试手段,研究溶液初始pH值、U(Ⅵ)初始浓度等因素对三种非活性微生物吸附U(Ⅵ)的影响,并探讨了不同强度γ辐照下三种非活性微生物对U(Ⅵ)的吸附动力学过程。结果显示:三种非活性微生物均能有效去除水体中的U(Ⅵ),并且是一个快速反应过程。溶液pH=5.0时吸附效果最佳。同等实验条件下,三种非活性微生物吸附U(Ⅵ)达到吸附平衡的顺序为酿酒酵母菌耐辐射奇球菌大肠杆菌。三种非活性微生物细胞通过细胞表面的羟基、氨基、羧基、羰基及磷酸基团的配位作用来吸附铀。γ射线辐照后,三种非活性微生物对U(Ⅵ)的吸附率明显低于未受辐照时的吸附率,原因可能是辐照因素改变了菌体表面的活性位点。实验用非活性微生物与U(Ⅵ)作用的激烈程度是细菌真菌。     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)基因文库的构建及应用~(32)P-DNA探针鉴定nif H基因亚克隆

采用入噬菌体置换型载体EMBL4,构建了水稻联合固氮菌Al-caligenes faecalis A15Hl菌株总DNA的基因文库。用Sau3AI限制酶完成部分酶切,取13～20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHI和SalI完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接,左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB 2688和E.coli BHB 2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6pfu,远远超过理论上所需的库容量。以~(32)P标记的nifH基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。以~(32)P-nifHDNA探针对所得重组噬菌体克隆之一(EMAFHl)进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRI酶切片段为nifH阳性杂交带。将其克隆到质粒pUC19DNA上后,转入受体菌JM101中,再经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFHl)含有粪产碱菌中的与nif H基因有同源顺序的片段。     

抗辐射菌lexA基因的克隆及在大肠杆菌中表达

研究了旨在克隆抗辐射菌Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ的ｌｅｘＡ基因并构建其表达载体,以便于进一步研究ｌｅｘＡ基因的功能及其在辐射抗性中的作用。主要的实验步骤包括分离提取抗辐射菌基因组ＤＮＡ,分离出ｌｅｘＡ基因并测定其序列,克隆于质粒载体ＰＵＣ１９,用电击穿孔法将重组的质粒导入在肠杆菌ＪＭ１０９,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测基因的表达。用定点突变技术,改变ｌｅｘＡ基因核糖体结合位点（ＲＢＳ）     

电离辐射对人肝细胞子代克隆热休克蛋白HSP60表达的影响

采用激光共聚焦显微技术和Western blot技术观察热休克蛋白60(HSP60)在受照人肝细胞克隆子代中的表达情况,并对其在不同受照剂量组中的表达量进行分析,探讨辐射对人肝细胞克隆子代HSP60蛋白表达的影响。结果显示HSP60蛋白主要集中于细胞核的周围,荧光定量分析结果表明HSP60蛋白表达量随着照射剂量的增加出现上调趋势。Western blot测定结果显示各剂量照射组克隆子代中HSP60蛋白随照射剂量的增加而表达增强,该结果与激光共聚焦显微观察结果一致。上述结果表明辐射可使受照人肝细胞子代中的HSP60蛋白表达发生改变,该结果可为探讨辐射诱发基因组不稳定性潜在的分子机理提供基础资料。     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)基因文库的构建及应用~(32)P-DNA探针鉴定nif H基因亚克隆

采用入噬菌体置换型载体EMBL4,构建了水稻联合固氮菌Alcaligenes faecalis A15H1菌株总DNA的基因文库。用San3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13～20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SalⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接,左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB 2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6pfu,远远超过理论上所需的库容量。以~(32)P标记的nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原 位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。以~(32)P-nif H DNA探针对所得重组噬菌体克隆之一(EMAFH1)进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中,再经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH1)含有粪产碱菌中的与nif H基因有同源顺序的片段。