MEK特异性抑制剂U0126对A549细胞的放射增敏作用及机制研究

采用克隆形成实验检测U0126对A549细胞的放射增敏作用;MTT法检测U0126联合X-射线对A549细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测U0126联合X-射线对A549细胞周期的影响;蛋白免疫印迹杂交法检测p-erk蛋白在A549细胞中的表达;衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测A549细胞衰老的变化。结果显示,U0126使p-erk蛋白表达下降,能够增加A549细胞的放射敏感性,放射增敏比为1.18。单纯使用U0126能明显抑制A549细胞的增殖,诱导G1期细胞阻滞并具有时间依赖性和剂量依赖性。U0126联合X-射线也能抑制A549细胞的增殖,增强G1期细胞阻滞现象和细胞衰老现象。以上结果表明,U0126能增加A549细胞的放射敏感性,其作用机制可能与细胞周期阻滞及细胞衰老增强有关。     

线粒体靶向6-(4-(二甲氨基)吡啶)甲基香豆素的合成及其辐射增敏作用

通过溴化和亲电两步反应得到线粒体靶向的抗肿瘤及辐射增敏药物6-(4-(二甲氨基)吡啶)甲基香豆素,探讨其对肺癌细胞系A549的抑制作用及辐射增敏作用。采用MTT法检测其对A549细胞的抑制率;克隆形成法检测辐射增敏作用(通过多靶单击方程拟合A549细胞的吸收剂量存活曲线,求出辐射增敏比,评价增敏效果);DCFH-DA法测定活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量。结果表明:A549细胞抑制率与药物浓度基本呈正相关;和照射组相比,联合组(照射加给药)存活分数明显降低(p0.05),辐射增敏比RSE=1.585;各剂量下,联合组与照射组相比,ROS均有显著性提高(p0.05)。结果提示,6-(4-(二甲氨基)吡啶)甲基香豆素对A549细胞具有抑制作用,且呈剂量依赖性;对A549细胞具有辐射增敏作用;可以显著提高A549细胞中的ROS含量。     

NU7026对肝癌细胞放射增敏作用及机制研究

为给研制新的抗癌和放射增敏药物提供理论依据,采用Westernblot检测DNA—PKcs在肝癌细胞中的表达水平及NU7026对DNA—PKcs活性的影响,以彗星实验表达检测细胞DNA受损的情况,微核实验观察染色体损伤,克隆形成实验观察对细胞株放射敏感性的影响。结果表明,DNA．PKcs在肝癌细胞中呈高表达,NU7026能抑制辐射所诱发的p-DNA—PKcs／S2056的活化,微核实验及彗星实验检测表明,NU7026能有效延长辐照后细胞的修复时间,并能明显降低放射后细胞的克隆形成率。提示NU7026对肝癌细胞有放射增敏作用,其作用机制与抑制DNA-PKcs活性有关。     

TGF-β1抑制剂增加H460肺癌细胞的放射敏感性

探索一种TGF-β1受体激酶的选择性抑制剂SB431542对H460非小细胞肺癌细胞的放射增敏作用及对其DNA损伤应答体系的干扰。采用克隆形成实验检测SB431542对H460细胞放射敏感性的影响;用移植瘤实验验证SB431542在体内对H460细胞的放射增敏作用;采用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡;用免疫荧光检测53BP1 foci和磷酸化的DNA-PKcs foci。结果发现,SB431542可增加H460的放射敏感性。照射前用SB431542预处理H460细胞虽然快速启动了细胞的DNA损伤应答反应,但却抑制了DNA双链断裂的非同源末端链接修复,因此,导致细胞残留更多未修复的DNA双链断裂,从而产生更严重的细胞周期阻滞。研究还发现,这种增敏作用与细胞凋亡无关。体内移植瘤实验表明,与单独照射组相比,连续3次用SB431542联合5 Gy的X-射线处理明显在处理后第5~12 d之间降低了肿瘤的生长。这些结果显示,在照射前用SB431542抑制肿瘤细胞的TGF-β1通路,能降低其DNA损伤修复能力,改变细胞周期分布,降低细胞克隆形成能力,延缓肿瘤的生长,因此用SB431542抑制TGF-β1通路可作为一些类型肺癌病人放疗的有效辅助手段。     

环氧化酶抑制剂Celecoxib增强脑胶质瘤SHG44细胞辐射敏感性的体外实验研究

为了研究COX-2选择性抑制剂celecoxib对人脑胶质瘤细胞SHG44的辐射增敏作用,用MTT法检测celecoxib对细胞存活分数的影响,用克隆法、RT-PCR法检测celecoxib或联合60Coγ射线照射与细胞克隆存活率及COX-2 mRNA表达水平的关系,探讨celecoxib辐射增敏的可能作用机制,为临床有效治疗胶质瘤提供实验依据.结果表明celecoxib细胞毒性作用随浓度升高而升高;celecoxib能抑制细胞克隆形成,联合60Coγ射线照射显示出协同作用;与对照组、单独药物和照射组相比较,celecoxib联合照射后COX-2 mRNA的表达水平均有所降低.本实验研究认为COX-2选择性抑制剂celecoxib对人脑胶质瘤SHiG44细胞具有辐射增敏作用,其机制与COX-2 mRNA表达水平密切相关.     

X射线联合沙利度胺对胶质瘤U251细胞的抑制作用

为探讨X射线联合沙利度胺对胶质瘤U251细胞的抑制作用,采用H~3-TdR掺入法和细胞克隆形成法检测沙利度胺增强U251细胞的辐射敏感性;细胞划痕实验观察沙利度胺抑制U251细胞的浸润能力.结果表明,沙利度胺能够抑制U251细胞浸润、DNA合成和克隆形成,与X射线联用后抑制作用增强,表现出协同作用.当细胞存活率为50%时,60 μg/mL、100 μg/mL 沙利度胺的辐射增敏系数为1.18和1.51.实验证明X射线联合沙利度胺能显著提高胶质瘤U251细胞的辐射敏感性,对U251细胞具有辐射增敏作用.     

Tamoxifen联合γ线照射对脑胶质瘤细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用

研究三苯氧胺（Tamoxifen，TAM）对人脑胶质瘤细胞辐射增敏作用及诱导细胞凋亡。用^3H-TdR掺入法、免疫组织化学法、流式细胞术和激光共聚焦显微镜扫描技术检测细胞DNA合成、雌激素受体表达、细胞凋亡及凋亡的形态学特征。结果表明，TAM能抑制细胞DNA合成，与^60Coγ线联用抑制作用增强，表现出协同作用。TAM能诱导细胞凋亡，其凋亡率随TAM浓度的升高而增高，凋亡细胞核固缩和核碎裂，可见凋亡小体。而免疫组化结果显示SHG-44细胞不表达雌激素受体。以上结果表明TAM可能通过诱导细胞凋亡途径来增加细胞的辐射敏感性，而与雌激素受体途径无关。     

LGK-974对人肝癌细胞系HepG2的辐射增敏作用

观察LGK-974(CAS:1243244-14-5)对人肝癌细胞系HepG2的辐射增敏作用,并探讨可能的作用机制。应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测LGK-974对HepG2细胞的生长抑制作用;细胞克隆形成法确定1.0mmol/L LGK-974对HepG2细胞放疗敏感性的影响;H2DCFH-DA探针流式细胞法检测细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;RT-PCR及Western Blot法检测Nrf2及其下游NQO-1、HO-1基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示,LGK-974抑制HepG2细胞的生长分裂和增殖,24、48、72 h的半抑制浓度(IC50)为4.3、2.14、0.536mmol/L(p0.05);1.0mmol/L LGK-974对HepG2细胞的放射增敏比(SERD0)为1.37;LGK-974能增大辐射产生的ROS水平(p0.05);照射后Nrf2及其下游基因HO-1、NQO-1的转录水平和表达水平均增加;LGK-974能降低辐射对Nrf2、HO-1和NQO-1的转录和表达水平的增加作用(p0.05)。由此得出,LGK-974对人肝癌细胞系HepG2具有明显的辐射增敏作用,其机制可能是抑制Nrf2信号通路,阻止细胞缓解辐射产生的氧化压力。     

槲皮素对人宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响

为观察槲皮素对人宫颈癌细胞HeLa增殖及其放射敏感性的影响，以人宫颈癌细胞株HeLa为研究对象，以MTT比色法和克隆形成实验检测槲皮素对HeLa细胞生长的抑制作用，并以克隆形成实验观察槲皮素对HeLa细胞株放射敏感性的影响。结果表明槲皮素能明显抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖，存在剂量依赖和时间依赖性。克隆形成实验显示槲皮素对HeLa细胞的作用可分为两部分，一部分抑制HeLa细胞增殖，另一部分为诱导HeLa细胞死亡。克隆形成实验也显示槲皮素联合X射线照射能著显降低照射后HeLa细胞的存活率。本实验研究认为槲皮素具有放射增敏作用，为临床开展放射线联合槲皮素治疗肿瘤的研究提供了实验依据。     

沉默生存素基因增强人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性

为探讨沉默生存素(Survivin)基因对人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响,利用靶向Survivin基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)质粒pGenesil-survivin,采用阳离子脂质体介导法转染SMMC-7721细胞后48 h,分别以RT-PCR和Western blot法检测Survivin基因mRNA和蛋白表达,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果表明,转染质粒pGenesil-survivin后48 h,SMMC-7721细胞Survivin基因mRNA和蛋白表达水平与对照和阴性干扰组相比明显降低(p0.05);转染后第1—4 d,细胞增殖活性与对照组相比明显降低(p0.05或p0.01);转染后48 h,细胞阻滞于G2/M期(p0.001),凋亡百分率明显高于对照组(p0.001);转染后SMMC-7721细胞D0值减小,放射敏感性增强,增敏比为1.24。结果提示,沉默生存素基因可增强人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性。     

125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞的旁效应

观察125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞损伤的旁效应.选择对高剂量率外照射敏感性不同的A549人肺腺癌细胞和NCI-H446人小细胞肺癌细胞,采用125I籽源离体照射细胞模式,将直接受照细胞与未受照细胞共培养24h,应用CB微核法和γH2AX荧光免疫分析法,检测2Gy和4Gy125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞的微核形成和DNA双链断裂水平.结果表明,125I籽源照射能显著诱导A549和NCI-H446细胞的微核形成率和γH2AX位点形成率增加的旁效应,显示增强对肿瘤细胞的杀伤作用.旁效应强弱与累积照射剂量、肿瘤细胞的辐射敏感性相关:对高剂量率外照射敏感的NCI-H446细胞对低剂量率照射及其旁效应的敏感性高于A549细胞,但与直接辐射效应相比,125I籽源照射诱导A549细胞旁效应高于NCI-H446细胞,这两种细胞的辐射旁效应均随累积照射剂量增加而降低,提示介导旁效应的信号因子水平可能随细胞损伤程度的增加而下降.     

电离辐射联合顺铂对人肺癌细胞中BTG3基因表达的影响

加速器产生的6-MV X-射线一次性照射体外培养的人肺腺癌细胞株A549和SPCA-1,细胞的吸收剂量分别设置为0、1、3、5和8 Gy,细胞照射后24 h及单次接受5 Gy照射后6、12和24 h后取样;X-射线联合顺铂对BTG3表达的影响研究设立单纯照射组(5 Gy)、顺铂处理组(20μmol·L-1顺铂)和联合处理组(5 Gy+20μmol·L-1顺铂),上述实验均以未给予任何处理的细胞为对照组;采用Western blot及RT-PCR法检测受到不同剂量电离辐射及照射后不同时间肿瘤细胞中BTG3表达水平。Western blot与PCR检测结果均显示,A549和SPCA-1细胞在受到不同剂量的X-射线照射后24 h,其BTG3蛋白及mRNA表达量均明显增加,并随电离辐射剂量的增加而增加,与对照组比较有统计学差异(t=5.25-15.75,p0.05);照射后不同时间检测结果显示,细胞在X-射线照射4 h后BTG3蛋白及mRNA的表达量即开始上升,并持续到照射后24 h,与照射前相比有统计学差异(t=7.52-11.18,p0.05);联合处理组BTG3的表达量均明显高于单纯照射组、顺铂处理组和对照组(t=7.02-15.86,p0.05)。电离辐射联合顺铂可以上调肺癌细胞株中BTG3的表达,BTG3基因有可能作为肺癌放化疗的靶基因。     

Effect of p53 on lung carcinoma cells irradiated by carbon ions or X-rays

The study is to investigate the feasibility and advantages of heavy ion beams on radiotherapy. The cellular cycle and apoptosis, cell reproductive death and p53 expression evaluated with flow cytometry, clonogenic survival assays and Western blot analysis were examined in lung carcinoma cells after exposure to 89.63 MeV/u carbon ion and 6 MV X-ray irradiations, respectively. The results showed that the number colonyforming assay of A549 was higher than that of H1299 cells in two radiation groups; A549 cellular cycle was arrested in G2/M in 12 h and the per-centage of apoptosis ascended at each time point of carbon ion radiation with doses, the expression of p53 upregulated with doses exposed to X-ray or carbon ion. The cell number in G2/M of H1299 and apoptosis were increasing at all time points with doses in 12C6+ ion irradiation group. The results suggested that the effects of carbon ions or X rays ir-radiation on lung carcinoma cells were different, 12C6+ ion irradiation could have more effect on upregulating the ex-pression of p53 than X-ray, and the upregulated expression of p53 might produce the cellular cycle G2/M arrested, apoptosis increasing; and p53 gene might affect the lung cancer cells radiosensitivity.     

靶向MDM2反义寡核苷酸增强肺癌细胞A549的辐射敏感性

放射治疗在肺癌的治疗中起着重要的作用。然而，提高肺癌的治愈率是一个重要的课题。MDM2基因在肿瘤的形成和增殖过程中起着重要的作用，可能是一个重要的靶基因。本研究自行设计了针对MDM2的反义核酸药物，通过RT-PCR和Western blotting检测其抑制效率，然后通过流式细胞仪观察转染细胞受5Gy照射后的细胞死亡情况，MTT观察细胞照射后的增殖能力。结果发现通过反义治疗的策略成功降低了MDM2在肺癌细胞中A549中的表达，这导致了A549细胞辐射敏感性的增加。表明MDM2参与了A549的辐射抗性的形成，靶向MDM2的反义寡核苷酸可以增强肺癌细胞A549的辐射敏感性。     

60Co γ射线照射人肝癌细胞诱导PIF1基因mRNA变化

分别用2 Gy和4 Gy ⁶⁰Co γ射线照射人肝细胞HepG2,利用real-time PCR方法检测PIF1基因mRNA表达量的变化,以探讨PIF1基因是否参与电离辐射致DNA损伤应答。结果表明,不同剂量的γ射线照射HepG2细胞后,PIF1 mRNA表现出一致的变化规律:即照后先轻微降低随后一直高表达,高表达至少持续到照射后12 h。提示电离辐射能够诱导PIF1表达,表达水平与剂量、时间相关。     

大鼠吸入氡及其子体后的DNA损伤效应

研究氡及其子体对大鼠外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、肺细胞、支气管肺泡灌洗液(Bronchi alveolar lavage fluid, BALF)细胞以及脾和胸腺细胞DNA的损伤作用。雄性SD大鼠吸入氡及其子体的累积剂量分别为66、111、174工作水平月(Working level month, WLM)后,收集BALF细胞,制备肺、脾脏和胸腺组织的单细胞悬液,采用单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE)技术,检测细胞DNA链的断裂改变。结果表明, 大鼠吸入氡及其子体后,各照射组PBMC、BALF和肺细胞DNA链断裂的迁移长度显著增加(p<0.01)。其中, PBMC与肺细胞DNA损伤有相关性(r =0.887, p<0.01),直线拟合(R2=0.787)的回归方程为Y=0.978X-0.12。在本实验的照射剂量下,氡及其子体能引起PBMC、BALF和肺细胞的DNA链断裂的损伤。     

Assessment of mouse BMMNC DNA damage with a two-tailed comet assay after X-ray and carbon ion total body irradiation

The two-tailed comet assay(2T-comet assay) is a method for simultaneously evaluating DNA single-strand breaks(SSBs) and double-strand breaks(DSBs). In the present study, the endonuclease DNase I and hydrogen peroxide were used to induce DSBs and SSBs in bone marrow mononuclear cells(BMMNCs) from mice, and the damaged DNAs were assessed with a 2T-comet assay. The results demonstrated that this method can detect and discriminate between BMMNC DNA SSBs and DSBs simultaneously. Using this method, we studied DNA damage in BMMNCs from female BALB/c mice after total body irradiation with X-rays and carbon ions. The results indicated that these two types of radiation induced serious DNA damage in BMMNCs in a dose-dependent manner.The DNA damage induced by carbon ions was more severe than that induced by X-rays at the same dose, and a high dose of carbon ion radiation was more likely to cause death in mice. The DSBs and SSBs induced by X-rays were the highest on the 3rd day post-IR. For carbon ion radiation,DSBs were the most serious on the 3rd day, while SSBs were more obvious on the 3rd day and 13th day post-IR.The ratio of DSBs/SSBs was clearly related to the different types of radiation.     

放射性核素153Sm诱导不同肿瘤细胞凋亡及相关基因表达研究

采用细胞抑制率实验、光镜、电镜、流式细胞仪和免疫组化方法研究了^153Sm作用于前列腺癌PC—3细胞、乳腺癌ER—75—30细胞和肺癌A549细胞后对细胞的抑制作用，诱导肿田细胞凋亡的时间剂量效应关系和周期依赖性以及凋亡相关基因bcl—2和bax蛋白在其中的表达情况。结果显示，^153Sm对3种肿田细胞有明显的杀伤作用，能诱导肿田细胞产生凋亡的形态学变化，并且随着浓度的增大和时间的延长，凋亡率增加，且呈时间剂量和周期依赖性。比1—2表达减弱，bax表达增强，细胞阻滞于G2／M期，bcl—2和bax基因均参与^153Sm诱导细胞凋亡过程。3种细胞对^153Sm的敏感性由高到低依次为PC—3细胞、ER—75—30细胞和A549细胞。