Ⅱ型限制性内切酶EcoR Ⅰ中非特异性核酸内切酶杂质测试技术研究

非特异性核酸内切酶杂质是影响II型限制性内切酶质量的重要因素,该文以EcoR I为例对II型限制性内切酶中非特异性核酸内切酶杂质进行了测试方法研究,以ΦX174 RF I型DNA作为底物,结果显示90U EcoR I中未检出非特异性核酸内切酶杂质,并对测试方法进行了方法学考察,显示该方法的重复性、稳定性佳,90U EcoR I可检测到0.1 U的Pst I。     

人硒蛋白SelK在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建硒蛋白SelK的重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP.方法:利用PCR、酶切和连接酶连接等技术将硒蛋白selk连接到质粒pGEX-6P-1上,通过酶切、序列测定进行鉴定.通过IPTG诱导重组载体在BL21大肠杆菌中表达,并筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间.结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的SelK-GFP融合蛋白,占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式表达.结论:成功构建了pGEX-6P-1-SelK-GFP重组表达质粒,为进一步研究硒蛋白SelK的功能、抗体制各打下了基础.     

可在鱼体内表达hu-IFN-α的基因重组构建及转化

通过分子重组,将人α－干扰素（hu-IFN-α）基因编码序列克隆到鲤鱼β－肌动蛋白基因启动子下游,构成成能在鱼体内组成型表达hu-IFN-α的基因重组分子。经限制性酶切分析、Southern杂交和序列测定,证明重组分子构建的正确性。采用显微注射法将这一重组基因转化草鱼受精卵,获得了表达人α-干扰素的转基因草鱼。     

位点特异性重组酶Cre的克隆、表达、纯化及体外活性鉴定

克隆了Cre基因，分别构建了真核表达载体pEF-EBFP-Cre和pGEX-Cre，在大肠杆菌中表达了Cre重组酶，并证明了重组酶的删除特性，为进一步在转基因动物乳腺生物反应器中使用此酶打下基础。     

恶性疟原虫FCC1／HN株P190抗原保守区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｐ１９０是恶性疟原虫裂殖子表面抗原，是很有希望的疟疾疫苗候选抗原。采用ＰＣＲ方法克隆了我国海南省ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐ１９０抗原基因的３个保守区片段，连接到ｐＵＣ１８载体上进行ＤＮＡ序列测定，然后分别与表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ连接，经双酶切鉴定后转化感受态ＪＭ１０９大肠杆菌进行高效融合表达。     

用温度诱导融合表达含内蛋白子的人神经营养因子-3

将重组质粒 pTXB NT3(6 9kb)与载体 pJLA50 3(4 9kb)分别用Nde 1/BamH 1双酶切 ,然后将前者的人神经营养因子 3 内蛋白子 几丁质结合区 (hNT3 in tein CBD)DNA片段插入后者载体中 ,构建成一个含内蛋白子的温度诱导型表达载体pLZY0 1。经转化后 ,工程菌E coliBL2 1/ pLZY0 1在LB培养基中培养 ,表达产物约为4 2kD的hNT3 intein CBD融合蛋白 ,经DTT不完全化学拆除后 ,可得约 15kD的hNT3,2 7kD的intein CBD及 4 2kD的融合蛋白 ,产物经鸡胚背根神经节测定其生物活性 ,融合蛋白在 80ng ,hNT3在 2 5ng时能较好地促进神经纤维的伸长。     

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料,构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列,通过PCR的方法,扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段,构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作,可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后,高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序,将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测,证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此,大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC,将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

HIV-1核心蛋白Gag与IL-6共表达重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性研究

分别将IL-6和HIV-1gag基因插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTAL串联启动子和复合启动子(ATI-P7．5)下游，构建了重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GAG-IL6。经同源重组和Western blot检测，获得重组鸡痘病毒，并将该重组病毒免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠血清抗体水平和特异性CTL杀伤活性。结果获得的重组鸡痘病毒可同时表达HIV-1核心蛋白和IL-6，并在感染细胞内形成病毒样粒子。重组病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

中国人IL－9cDNA的亚克隆及其高效表达

在完成了ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的克隆及序列测定的基础上，为实现ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ在原核细胞中的表达，重新合成了上游引物（在酶切位，久后加上ＡＴＧ）。以ｐｕｃ１９－ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，特异产物经ＥｃｏＲＩ酶切、回收后与经ｓｍａｌＩ、ＥｃｏＲＩ酶切的ｐＢｖ２２０载体连接，转化大肠杆菌。转化子质粒用０．８％ａｇａｒｏｓｅ电泳粗筛，经ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ酶切后得到了３个阳性克隆。３个阳性克隆经热诱导后，在ＰａＰ＿Ｌ启动子作用下，获得了天然ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的高效表达，表达量分别达到可溶性总蛋白的３７．３％、４３．８２％、５４．５２％。     

蚓激酶乳腺组织特异性表达载体构建及在山羊奶中的表达

以合成的蚓激酶cDNA突变体为目的基因,构建了其乳腺组织特异性表达载体pIbCP-LK-neo和含有两个目的基因拷贝的表达载体pIbCP-LK-LK。以山羊乳腺作为生物反应器,在稳定泌乳期于乳腺组织分别注射以上两种表达质粒,采集乳汁,通过纤维蛋白平板溶圈试验进行纤溶活性测定。结果显示,注射了蚓激酶表达质粒的山羊奶具有明显的纤溶活性;pIbCP-LK-LK蚓激酶在奶中的表达量高于pIbCP-LK-neo。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明,表达的蚓激酶分子量为26kDa。本试验系首次实现了蚓激酶的基因工程表达,为通过转基因途径生产蚓激酶奠定了基础。     

中国对虾部分基因组文库构建和微卫星DNA序列的筛选

以中国对虾为实验材料,提取肌肉的基因组DNA。经Bsp143Ⅰ酶切后,回收500～1000bp的DNA片段,与经BamHⅠ酶切并去磷酸化的PUC19重组,将重组载体转入大肠杆菌DH5α中。然后将其涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,过夜培养后,经蓝白斑筛选,构建对虾部分基因组文库。采用载体质粒的通用引物进行PCR检测插入片段的大小,对基因组文库进一步进行筛选。从建立的文库中选取100个片段大小合适的克隆进行测序,其中54个克隆的DNA插入片段含有微卫星序列,共获得了111个微卫星序列,在GenBank中注册了12个微卫星序列。本实验中还发现1个含有23bp的小卫星序列。     

真核基因转移,整合和表达载体MAR的研究

真核基因转移、整合和表达载体ＭＡＲ的研究周丛照，李振刚（中国科学技术大学生物系合肥２３００２７）限制性内切酶的发现和应用为原核生物基因工程的发展开辟了广阔的前景，但真核生物由于基因组结构和功能的复杂性而给基因工程带来了极大的困难。尽管我们采用导入外源...     

表达人白细胞介素—2的重组腺病毒的制备

携带人白细胞介素－２ ｃＤＡ序列的Ｅ１区缺陷的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＬ２－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉地共转染２９３细胞，经同源重组，获得了一个腺病毒噬斑。抽提腺病毒ＤＮＡ，运用ＰＣＲ扩增及ＸｂａＩ酶切检测，证实这一噬斑为带有人ＩＬ－２ ｃＤＮＡ序列的重组腺病毒。受其感染的２９３细胞和人黑素瘤Ａ３７５细胞上清中，都能够测出ＩＬ－２的活性，表明制备的重组腺病毒是能表达人ＩＬ－２的。     

人骨形态发生蛋白－1（hBMP－1）成熟肽的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ方法从ＢＭＰ－１的ｃＤＮＡ中克隆了ＢＭＰ－１成熟肽的编码基因，删除了ＢＭＰ－１前体分子Ｎ端的信号肽序列和Ｃ端的其他序列。用ＨｉｎｄⅢ消化１．３Ｋｂ的ＰＣＲ产物，将０．８４和０．４６Ｋｂ两片段分别克隆到ｐＵＣ载体中进ＤＮＡ序列分析。分别酶切回收ＥｃｏＲ－ＨｉｎｄⅢ和ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ两目的基因片段，与大肠杆菌表达载体ｐＢＶ－２２０进行退火连接，使插入基因受控于Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子。将含有ＢＭＰ－１成熟肽编码基因重组表达质粒ｐＢＶＢＭＰ－１转化大肠杆菌宿主细胞进行温度诱导表达。结果表明，经４２℃热诱导后，大肠杆菌能以包涵体形式表达ＢＭＰ－１成熟肽，其分子量约为５２ｋＤａ。     

以融合蛋白形式在E·Coli中表达人神经生长因子

将人神经生长因子基因（hNGF）克隆到pMalC2质粒中，构建了表达产物为麦芽糖结合蛋白（MBP）与hNGF的融合蛋白重组质粒。经由内切酶再水解及DNA序列测定等分析表明，重组质粒含hNGF基因（360bP），该质粒在E·Coli中的表达产物为融合蛋白MBP－hNGF（55kd），光密度扫描表明，其表达量约为30％。     

乙肝表面抗原S2S基因在蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中的表达研究

用PCR法将乙肝表面抗原基因S2S片段从乙肝病毒中扩增得到,将其插入到蓝藻热休克表达载体pEUTMT1中,构建成表达重组质粒pES2ST1.将蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的总染色体与质粒pES2ST1同时进行EcoRI和SacI双酶切,再连接构建成为系列含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒.经转化筛选得到蓝藻Synechococcus sp.PCC7942转化藻株.PCR和Southern 杂交证明目的基因已经整合到宿主的染色体中.转化藻通过热诱导后,Northern-blot结果呈阳性,用化学发光检测技术可以检测到微量目的蛋白的表达,检测含量约为0.78～0.64ng/ml,目的蛋白约为可溶性蛋白的1.1×10-6～1.5×10-6.     

豌豆铁蛋白基因植物转化载体的构建

实验将 Ca MV35 S启动子控制下的铁蛋白基因构建于植物双元表达载体 p Cambia 130 1中 ,并将该重组载体导入农杆菌超毒力菌株 EHA10 5 ,以建立适合于禾本科的植物转化系统 ,为铁蛋白基因的转基因及其功能研究奠定基础     

真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定。序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整,在体外获得了高效表达的重组蛋白,高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,过长时间的诱导,对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化。