去泛素酶复合体Ubp3/Bre5的制备及与Cdc48作用（英文）

泛素化是一种存在于真核细胞中与生理功能密切相关的蛋白修饰,泛素化与去泛素化处于动态调节过程中.Ubp3是与人USP10同源的酵母去泛素化酶,结合辅引子Bre5在细胞内发挥广泛作用.为研究该复合体的工作机制,制备重组蛋白复合体,在大肠杆菌中成功表达并纯化重组Ubp3与Bre5单体及Ubp3/Bre5复合体,首次成功大规模制备重组Ubp3/Bre5复合体.通过一系列pulldown实验,检验Ubp3/Bre5与AAA家族中泛素选择性ATP酶Cdc48的相互作用模式,结果发现,Ubp3及Bre5无法单独与Cdc48结合,但Ubp3/Bre5复合体可以有效与Cdc48相互作用.提出了Ubp3/Bre5-Cdc48相互作用的新模式,制备了高质量重组Ubp3/Bre5复合体.该研究为通过生化及结构生物学进行分子机制探索奠定了基础.     

UbcH5B活性位点突变体对野生型E2传递泛素活性的影响

蛋白质泛素化需要泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的依次作用,但泛素结合酶E2不仅在泛素传递中起中间者的作用,还可能决定泛素链的特异性以及调控泛素化过程.为了更加深入了解E2参与的泛素传递调控机制,通过将泛素结合酶UbcH5B催化活性位点Cys85突变成Ser,获得可以与Ub结合得到更加稳定复合物的突变体UbcH5B-C85S,探究突变体对野生型E2体外泛素传递的影响.首先构建野生型E2和UbcH5B-C85S的表达质粒,然后通过原核表达和使用Ni-NTA亲和柱层析纯化,获得有活性的人重组E2蛋白;设置体外泛素转移反应,通过Western blot等方法,分别在E2和E3水平分析UbcH5B-C85S对野生型E2泛素转移反应的作用.结果 显示:突变体UbcH5B-C85S可以部分抑制泛素从E1传递到UbcH5B和E2-25K,并且可以抑制UbcH5B将泛素传递到泛素连接酶TRIM23.这些结果有助于更深入了解泛素化的活性调控机制.     

仿刺参过氧化氢酶的克隆、表达及纯化

采用RT-PCR技术从仿刺参肠道组织中克隆了过氧化氢酶(Aj-CAT)蛋白的编码序列(CDS)。通过PCR扩增,成功构建了含有Aj-CAT编码序列的重组表达载体pET28c-Aj-CAT。通过热激法获得用于外源表达仿刺参过氧化氢酶蛋白的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28c-Aj-CAT。IPTG诱导后,SDS-PAGE检测发现,基因工程菌能够在体外成功地表达融溶状态的仿刺参过氧化氢酶蛋白。利用镍离子亲和层析柱分离纯化,经200 mmol/L咪唑洗脱后,成功得到纯度为97.6%、能够清除过氧化氢的Aj-CAT蛋白。     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌(IAM11001)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB,构建具T7强启动子的PET-20-(b)-BgaB质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，经IPTG诱导的后，重组菌周质中乳糖酶酶活达到0.12U/mL，胞内酶活为1.35U/mL，比酶活为6.66U/mg蛋白，比酶源菌产生的酶活提高5倍，通过对IPTG诱导时机，诱导浓度和诱导时间的优化研究，重组细菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的90倍。     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

小鼠肝脏羧酸酯酶的cDNA克隆、表达及应用

从小鼠肝脏中克隆羧酸酯酶（CES）基因家族成员Ces1f的cDNA,在大肠杆菌中表达,并验证重组酶对农药的作用。采用RT-PCR克隆Ces1f cDNA,与pUCm-T载体连接测序后,亚克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-Ces1f,转化到宿主菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,采用Ni柱对表达产物进行纯化并测重组CES的酶比活,利用HPLC验证重组酶对不同农药的作用。结果显示：成功获得纯化的77kDa的重组CES蛋白,其酶液的比活为55.37U/mg,HPLC检测发现重组CES对西维因、呋喃丹及甲基对硫磷等具有降解作用。成功表达重组CES,其对农药具有降解作用,为环境中农药残留的降解奠定了基础。     

自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测

为了提纯并鉴定自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体,探讨其在部分组织中的免疫定位．首先合成带谷胱甘肽转移酶标签的自噬基因融合蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体浓度,最后用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测抗体效价,蛋白印迹检测抗体特异性及在组织中的表达情况．结果表明：制备得到自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其质量浓度为每10μL含5μg,用酶联免疫吸附法显示此抗体效价及特异性较高,蛋白印迹显示蛋白大小为55kD左右．     

黑曲霉bgl基因在毕赤酵母中的表达研究

为构建具有分泌黑曲霉β-葡萄糖苷酶活力的酵母工程菌,探讨β-葡萄糖苷酶基因(bgl基因)在酵母菌中的表达情况.克隆了黑曲霉bgl基因的cDNA片段,利用质粒pPICZαA构建了该基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导培养,检测结果表明黑曲霉bgl基因已成功转入酵母菌中并可正常表达,重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶水解活性,在诱导培养72 h后,发酵液的酶活力可达到0.78 U/mL.     

FGFR3胞外区在酵母中的表达

对酵母中FGFR3胞外区蛋白表达进行研究.从pCDNA3.1-myc-His-FGFR3N中酶切得到带有myc/His标签的FGFR3胞外区DNA片段,将其克隆到pYES2中;采用醋酸锂转化法,将重组质粒转入酵母INVSc1;转化子经半乳糖诱导后,提取总蛋白进行Western-blot分析.测序结果表明:pYES2-myc-His-FGFR3N载体构建成功,Western-blot分析证实重组转化子在酵母中表达了与预期分子量大小吻合的FGFR3胞外区蛋白.     

齿轮—五杆机构的轨迹特性研究

采用计算机机构动画仿真的方法，对齿轮五杆机构的轨迹特性进行了研究。分析了该机构双曲柄存在的条件，两连杆铰接点Ｃ的轨迹曲线可到达的区域及该轨迹曲线形状随机构结构参数的不同而变化的规律，从而为齿轮五杆机构的轨迹综合提供了重要依据。     

数学优化方法在新安江模型参数率定中的应用分析

以3种数学优化方法及新安江(三水源)模型的理论为依据,介绍了优化方法在新安江三水源模型参数率定中的应用.将率定成果与API模型进行了对比,说明这3种优化方法在大宁河流域参数率定中应用效果良好,具有很好的参考和推广价值.     

浅析资产减值会计对利润的操纵

会计制度规定企业定期或者至少于每年年度终了，对各项资产进行全面检查，合理地预计各项资产可能发生的损失，并计提资产减值准备，既不高估资产或收益，也不少计负债或费用，从而避免虚增企业利润。但在实务中，一些企业却利用会计法规准则中的原则性，通过资产减值准备达到操纵会计利润的目的，本文即是从企业滥用资产减值入手，以实例来揭示企业计提秘密准备的意图，以引起业内人士的重视。     

高等学校固定资产计提折旧问题探讨

中国现行会计制度规定,高等学校的固定资产不计提折旧。随着经济的发展和高等教育的改革,高等学校的经济成分越来越复杂,固定资产管理和核算中暴露出来的问题越来越突出。针对现行高校固定资产计价模式存在的问题,提出了对高校固定资产计提折旧的设想,研究了高校固定资产折旧的范围、折旧年限、折旧方法及会计处理办法。     

对董事自相交易忠实义务的研究

自相交易是指董事代表公司的利益与自己或者与自己有利益关系的其他公司或者企业进行的交易,是忠实义务的核心问题。因此,董事的自相交易是董事信义义务所要规制的主要方面。比较了英美法系和大陆法系的交易互相规则;结合自我交易的具体内容,分析了我国公司法关于自相交易的相关规定。     

扬声器的自滤波特性与D类功放失真的改善

应用动圈式扬声器的电—力—声类比等效线路对动圈式扬声器的频率特性进行了初步的研究,提出了利用扬声器的自滤波性能改善因D类功放移相网络引起信号相位失真的方法。同时,采用比较、反馈的方法对音频信号的谐波加以抑制,使得数字功放的总体失真指数下降。     

红土颗粒粒度的分维变化特征

借助分形几何理论,探讨红土在不同处理方法下其颗粒粒度的分维变化特征结果表明：红土的颗粒粒度具有线性分形结构的特点是客观存在的事实,其分维值的大小反映了土中颗粒粒度的分布情况,并与土的物理力学性之间存在一定的关系分维是描述土的颗粒粒度的一个新的特征参数     

红豆杉原生质体制备和培养研究

采用不同浓度的纤维索酶和果胶酶混合液对红豆杉种子的胚进行了处理,采用3％ 0.5％(m／v)的纤维索酶 果胶酶混合液效果好．得到了红豆杉胚原生质体;同时采用了B5、V-KM、MS3种培养基对所得到的原生质体进行了初步培养;实验结果表明．采用V-KM附加椰子汁(含天然植物激素)培养基培养胚性原生质体效果较好,并研究了植物激素的浓度和光照强度等对愈伤组织的诱导的影响,表明采用IAA和NAA对愈伤组织生长效果较好,光照强度在1000lx生长效果较好.     

密炼机转子的刚度计算

介绍了变截面梁变形计算的初参数法，运用该方法求密炼机转子的变形，并得到了精确的解。     

黄蘑多糖提取及除蛋白方法的实验研究

采用L9(34)正交实验对黄蘑多糖(Polysaccharide of Huangmo,简称HMP)的提取条件进行了优化,对黄蘑多糖除蛋白的方法及条件进行了实验研究。实验结果确定热水提取多糖的最佳条件为:料液比1∶20,提取温度90℃,提取时间3h,多糖产率达21.32%;使用三氯乙酸法去除多糖的蛋白,当m(黄蘑粗多糖)∶m(三氯乙酸)=1∶6时,多糖质量分数达到83.7%。