利用酵母表达体系研究大豆SALI3-2蛋白功能

以含有大豆Sali3-2cDNA的重组载体为模版,扩增出SALI3-2蛋白及其缺失信号肽的SIcDNA片段,构建酵母表达载体pYES2/S、pYES2/SI以及可表达SALI3-2-His6的pYES2/SH.空载体pYES2/ct和重组载体在转化酿酒酵母INVSC1后得到相应的酵母重组子INV/CK(对照菌)、INV/S、INV/SI和INV/SH.Westernblot实验结果表明,SALI3-2蛋白在酵母INVSC1中可被半乳糖诱导表达.对INV/CK、转基因的重组菌INV/S、INV/SI在无胁迫、含1.5mol/LNaCl或山梨醇培养基中的生长情况进行分析.结果表明,大豆SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达对无胁迫条件下酵母的生长没有影响,而在NaCl胁迫下可明显提高酵母转化子的耐盐能力.信号肽的缺失使SALI3-2蛋白的耐盐能力有所下降,可见信号肽对该蛋白耐盐功能的发挥有重要作用.另外,SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达不能提高酵母重组子的抗渗透能力,表明SALI3-2蛋白对细胞不具有明显的渗透胁迫调节作用.     

嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426磷酸三酯酶在毕赤酵母GS115中的表达

将嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426中的磷酸三酯酶基因转入毕赤酵母GS115中,整合到染色体DNA基因组上,并进行诱导表达.SDS-PAGE和Western-blot试验结果显示,重组蛋白是一个分子量约为50KD的磷酸三酯酶二聚体.酶活检测证明重组蛋白具有较高的磷酸三酯酶活性,其最适温度为70℃,最适pH为10.0.     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA毕赤酵母表达载体的构建和表达

将掌叶半夏凝集素和死亡素的融合基因thanatin-linker-ppa定向连接到pPIC3．5K,构建酵母表达载体pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA并进行序列分析,经SalI单酶切线性化后电转化到GSll5毕赤酵母感受态细胞中,PCR鉴定后在含有G418抗性的YPD平板筛选高拷贝重组子。利用甲醇在BMMY培养基中诱导表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Westernbloting分析显示获得分子量约31kD的融合蛋白,融合蛋白经纯化后MTT分析其抗肿瘤活性,结果显示融合蛋白具有显著的抗肿瘤效果。     

大豆PM1蛋白抗氧化作用及提高酵母对铜耐受力

Cu~(2+)是植物生长必需的微量元素之一,但土壤中过量的Cu~(2+)会对植物细胞产生毒害作用.大豆GmPM1蛋白属于第4组的胚胎晚期富集(late embroygenesis abundant,LEA)蛋白,该组蛋白序列中富含组氨酸残基.研究大豆GmPM1蛋白在提高植物耐Cu~(2+)胁迫方面的保护作用及其机理.对大豆幼苗进行150μmol/L Cu SO_4胁迫实验.结果表明,Cu~(2+)胁迫会造成大豆幼苗叶片失水萎蔫;在胁迫3 h和24 h时,幼叶内GmPM1基因表达上调.构建了酵母表达载体p YES2-GmPM1,转化Cu~(2+)敏感型酵母(ΔYAP1)得到重组菌ΔYAP1-GmPM1.检测结果表明,表达GmPM1蛋白的酵母重组子对Cu~(2+)胁迫耐受力得到提高.采用Cu抗坏血酸体系,在体外检测出GmPM1及富含组氨酸残基的GmPM1-C端蛋白具有清除羟基自由基能力.研究表明,大豆GmPM1蛋白可通过其C端的组氨酸残基结合过多的Cu~(2+),清除由Cu~(2+)胁迫造成的细胞内产生的过量羟基自由基,提高植物及其细胞对Cu~(2+)胁迫的耐受性.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chit1真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chit1,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chitl真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chitl,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确.电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15 ku一致,其表达量占分泌总蛋白...     

Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of chit2 gene from Beauveria bassiana

To study recycled trashes from shrimps and crabs in the sea through chitinase secreted by microorganisms,the chitinase gene chit2 was cloned and sequenced from Beauveria bassiana by the polymerase chain reaction(PCR),and was ligated into the yeast expression vector pYES2.The expression vector plasmid was transformed into Saccharomyces cerevisiae H158.Gene expression took place upon induction with 2% galactose.The measurement of enzyme activity shows that the expression production can be expressed in active forms and secreted to the medium.The enzyme activity approaches the peak of 0.63 U/mL when the culture time is 36 h.     

聚类分析方法在DNA序列分类中的应用

从DNA序列片段个案中密码子分布密度角度出发,提取出DNA序列片段的特征,基于五大类氨基酸出现的频率,应用聚类分析方法对DNA序列片段进行分类.结果表明,该算法具有分类简单且分类结果精度较高的优点。     

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Ⅰ的克隆表达

为深入研究绿色木霉(Trichoderma viride)内切葡聚糖酶(EGⅠ)的特性与功能,利用Northern blot方法分析不同碳源条件下绿色木霉的egⅠ表达,采用RT-PCR方法从绿色木霉T4中克隆egⅠ基因的cD-NA序列,测序与生物信息学分析,并构建诱导型表达载体pYES2-egⅠ,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1和H158中表达.结果表明:绿色木霉在含有纤维素的液体培养基中生长,egⅠ高效表达,在秸秆中表达量最高.纤维二糖中表达量相对较低,在葡萄糖、果糖中没有表达.egⅠ基因编码框长度1 377bp,编码459个氨基酸.含有信号肽,为分泌蛋白,属于糖苷水解酶家族7,具有纤维素酶结合域(CBD)和催化域(CD).INVSc1转化子发酵培养48 h达到转录高峰期,60 h达到酶活高峰期,酶活为0.081 6 U/mL,酶活比H158转化子提高32.5%.     

关于集合划分的几个问题

本文对组合数学中的集合划分问题进行了一些探索,试图回答下面三个问题:①集合划分方法数P(N)的非递归算法,②划分向量V映射到划分序号D的算法,③划分序号D映射到划分向量V的算法。本文以划分的构造树为基础,加以变换,得到数目树和分块树,由此求得P(N),以及K块划分方法数P(N)_K。本文把划分向量V当成一种特殊的数制,找出其进位规则,从而求得V/D和D/V数制转换。所建立的算法经计算机验证,是正确的。     

人p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

构建了人p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）cDNA序列的绿色荧光真核表达载体,并鉴定其在人胚肾293（human embryo kidney293,HEK293）细胞中的表达．采用PCR方法从含人p75NTR的pDC316-HP75质粒中扩增目的片段,经EcoRI和SalI双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达载体pEGFP-N1-HP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及Western blot法鉴定人p75NTR的表达．结果表明,酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有人p75NTR编码序列,转染实验表明,重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的人p75NTR片段．     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达

选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.61提升到0.85。在基因的5'端融合编码α信号肽序列,在3'端融合编码6个组氨酸标签序列,并在N端编码α信号肽和编码成熟酸性β半乳糖苷酶基因间分别引入编码kex2和Ste13裂解信号序列。基因克隆到pPICZα-A表达载体,构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-β-Gal。在醇氧化酶(AOX1)启动子调控下,酸性β-半乳糖苷酶得到高效分泌表达,达到508 mg/L,比优化前提高3倍。重组酸性β-半乳糖苷酶具有天然的酸性β半乳糖苷酶相同的酶活性。     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.