Triton X-114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素

目的采用Triton X-114萃取法去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素。方法1% Triton X-114与多糖溶液在0℃混合均匀,分别加热至25、37和56℃,观察分层情况。离心后收集上层水相,对其中残余萃取剂Triton X-114进行去除方法的选择。比较多糖浓度对萃取的影响及二次萃取的效果,并对终产物进行全面检定。对W135群和Y群脑膜炎球菌多糖进行萃取效果比较。结果最终选择56℃10min作为升温条件,3000r/min离心10min后,上清中多糖的内毒率含量均减少85%以上,多糖回收率不低于80%。残余的Triton X-114选择透析法去除。多糖浓度越低,越易于萃取。二次萃取多糖回收率大于85%。内毒素含量可降低至0.706EU/μg多糖。经检测,终产物多糖的相对分子质量未发生改变,免疫原性与萃取前差异无显著意义,异常毒性、多糖及内毒素含量合格。蛋白含量稍有增加,核酸含量降低。W135群和Y群脑膜炎球菌多糖的萃取结果与A群多糖相似。结论Triton X-114萃取法可以用于去除脑膜炎球菌多糖中的内毒素。     

TritonX-114残留量检测方法的建立及验证

目的建立测定生物制品中Triton X-114残留量的方法,并进行验证及初步应用。方法先对Triton X-114进行光谱扫描,用所得到的特异吸收峰来初步检测Triton X-114的残留量,再根据Triton X-114与苯酚发生反应并产生具有一定浊度的复合物,且浊度与Triton X-114的浓度成正比的原理,通过测定340 nm处吸光度值,建立测定Triton X-114残留量的方法,并对方法进行稳定性、准确性、精密性验证。考察核酸和蛋白对Triton X-114含量测定的影响,并分别采用紫外吸光法和建立的方法检测样品中的Triton X-114含量。结果 Triton X-114在280 nm左右有特异吸收峰,可通过测定280 nm处的吸光度值来初步测定Triton X-114的残留量;利用Triton X-114与苯酚发生反应后产物的A340值来测定Triton X-114含量的方法的线性范围为0.001%~0.007%,检测下限为0.001%;建立标准曲线后,每间隔5 min测定1次A340值,各浓度标准品A340值的变异系数(CV)均小于5%;低(0.001%)、中(0.003%)、高(0.006%)浓度Triton X-114溶液连续测定3次,每个浓度平行测定9组的CV值均<5%,回收率均>100%;核酸和蛋白对该方法测定Triton X-114的含量无影响;4份样品经两种方法检测的试验内CV值均<10%。结论可采用280 nm紫外吸收法初步测定Triton X-114的含量,但该法灵敏度低,易受干扰;而采用Triton X-114与苯酚反应后检测其产物浊度的方法来测定Triton X-114的残留量,稳定性、精密性良好,准确性高,可用于生物制品中Triton X-114残留量的检测。     

相分离联合层析去除类人胶原蛋白中的内毒素

研究类人胶原蛋白(HLC)中内毒素的去除方法,为规模化制备医用生物材料提供参考。采用Triton X-114双水相分离法作为内毒素去除工艺的第1步,亲和层析法作为工艺的第2步,二者偶联操作从类人胶原蛋白中除去内毒素,并对除去内毒素后的HLC进行了理化性能检测。结果表明:采用Triton X-114双水相分离法,在蛋白质量浓度2.06 mg/m L,作用温度44.71℃,作用时间3 h,溶液pH值为7时双水相分离系数K=9.58,蛋白中内毒素含量由10 000—25 000 EU/mg下降为1.5—2.0 EU/mg,蛋白回收率为95.6%;偶联了多聚赖氨酸亲和配基的亲和层析后,HLC中内毒素含量由1.5—2.0 EU/mg降至0.025—0.25 EU/mg,蛋白回收率可达81.9%;2步操作均不会使蛋白发生相对分子质量及化学结构的改变。此工艺操作简便,可显著降低生产成本。     

去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索

目的探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题。方法选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经Capto SP Imp Res柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析。结果使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下。在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势。结论使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究。     

汉坦病毒DNA疫苗pVAX/G2诱导小鼠的免疫应答

目的探讨含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答。方法重组质粒pVAX/G2转染cos-7细胞,用间接免疫荧光法(IFA)检测瞬时表达产物。经碱裂解法提取质粒pVAX/G2,Sepharose CL-4B柱层析纯化后,免疫BALB/c小鼠(SPF),并采用含有人IL-2基因的重组质粒pVAX/IL-2及重组人IL-2蛋白作为DNA疫苗的佐剂,检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。结果重组质粒pVAX/G2能够在真核细胞中表达。免疫小鼠血清中能够检测到抗汉坦病毒中和抗体、酶标抗体和荧光抗体。淋转刺激指数和脾淋巴细胞上清液中IL-2活性,与空载体pVAX1阴性对照比较差异有显著意义。质粒佐剂pVAX/IL-2能显著提高DNA疫苗的细胞免疫水平。结论含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定强度的体液免疫和细胞免疫应答。     

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。     

口服CD226 DNA疫苗对小鼠免疫功能的影响

目的制备口服CD226 DNA疫苗,观察该疫苗对小鼠免疫功能的影响。方法以质粒CD226-PCR2.1-ToPo为模板,PCR扩增CD226基因,克隆至pcDNA3.1载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD226,利用脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染CT-26细胞株,采用RT-PCR法、Western blot法、流式细胞术检测CD226基因在CT-26细胞中的表达。将质粒pcDNA3.1-CD226用脂质体Lipofectamine TM2000包裹制成CD226 DNA疫苗(100μg质粒/100μl脂质体),经灌胃免疫C57BL/6小鼠,实验分CD226疫苗组、pcDNA3.1组和生理盐水组,流式细胞术检测CD226在小鼠脾细胞中的表达;还原酶法检测NO分泌水平;乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性;ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子(IL-2、IL-4、IFNγ和TNF-α)分泌水平;Real-time PCR法检测肠黏膜组织内细胞因子表达水平。结果质粒pcDNA3.1-CD226经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;质粒pcDNA3.1-CD226转染CT-26细胞的转染率为32.14%,转染的CT-26细胞检测到CD226蛋白表达。CD226疫苗组CD226 CD4+T细胞的绝对数、NK细胞杀伤活性、NO分泌水平、脾细胞培养上清中TNF-α、IFNγ和IL-2分泌水平、肠黏膜组织内TNF-α和IFNγ基因mRNA水平均明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P0.05);而CD226疫苗组脾细胞培养上清中IL-4分泌水平及肠黏膜组织内IL-2和IL-4基因mRNA水平,与pcDNA3.1组和生理盐水组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD226DNA疫苗经灌胃免疫,可诱导小鼠全身Th1型免疫应答增强和肠道局部部分Th1型免疫应答增强。     

hCAP-18/LL-37基因转染对RAW264.7细胞活化功能的影响

目的探讨抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对巨噬细胞RAW264.7活化功能的影响。方法将重组质粒pcD-NA4/Myc-His-hCAP-18/LL-37瞬时转染RAW264.7细胞,MTT法检测细胞的增殖活性;中性红吞噬试验检测细胞的吞噬能力;RT-PCR法分析细胞活化相关分子CD80、CD86、TLR4及细胞因子IL-1β、TNF-αmRNA的转录。结果 hCAP-18/LL-37基因转染可促进经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理的RAW264.7细胞的增殖活性与吞噬能力(P<0.05);可上调RAW264.7细胞CD80、CD86、TLR4、IL-1β、TNF-α基因mRNA的转录水平。结论 hCAP-18/LL-37基因转染可通过促进RAW264.7细胞增殖活性、吞噬能力及活化相关分子表达,调控巨噬细胞的活化功能。     

HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法的初步建立

目的初步建立HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法,并对HIV疫苗进行免疫原性评价。方法选择一种HIVDNA疫苗(D)、2种重组痘苗载体HIV疫苗(M和R),分别免疫BALB/c小鼠,6周后分离血清和脾淋巴细胞,采用ELISOPT和胞内因子染色法检测细胞因子分泌情况,MTS法检测淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测血清中抗-HIVIgG和IgA抗体水平。结果D、M和R疫苗均可诱导小鼠产生广泛的免疫应答,ELISPOT法可检出脾细胞分泌IFNγ、IL-2、IL-4和IL-6;胞内因子染色可检出IFNγ、IL-2和IL-4的分泌;D和M组脾淋巴细胞增殖试验阳性数高于R组;D、M和R组血清抗-HIVIgG抗体分别有0/5、1/5和5/5小鼠阳转,各组均未检出血清抗-HIVIgA。结论已初步建立了HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法。     

血浆制品中Triton X-100残留量测定方法的建立

目的 建立血浆(SD法病毒灭活)中Triton X-100残留量测定方法。方法 采用新型Oasis固相提取小柱进行样品预处理,用反相SymmetryShield RP18色谱柱的HPLC方法检测SD灭活法血浆中Triton X-100残留量,并对该方法进行讨论。结果 用固相提取方法可获得良好的回收率(99.2％),检测限达到1.0ppm,检测精度CV值为3.04％。结论 该方法快速、简便、准确,重现性好,可作为实验室SD病毒灭活血浆中Triton X-100检测方法。     

黄芪注射液中细菌内毒素与热原相关性研究及限度的确定

建立了黄芪注射液细菌内毒素与热原之间的关系,并确定其细菌内毒素的限度。用稀释16倍的黄芪注射液配成含不同浓度梯度的细菌内毒素系列样品,分别用动态浊度法和家兔法测定细菌内毒素和家兔最大升温值。结果表明,细菌内毒素方法建立中,黄芪注射液在稀释8～64倍后测定无干扰;细菌内毒素浓度与家兔体温升高值有相关性,回归方程为Y=0.448+e3.221 X(r2=0.997);进一步考虑热原检查法的偏差,黄芪注射液的细菌内毒素限度应不超过2.31EU/mL。因此,采用动态浊度法可对黄芪注射液中细菌内毒素进行测定并建立可靠的限度标准。对中药无菌制剂采用细菌内毒素测定法提供一种研究思路,同时为快速反映中药无菌制剂的热原情况提供一种有效的转换方法,尤其有利于中药无菌制剂中间体热原的控制。     

重组人干扰素α2b内毒素检查法的研究

目的研究鲎试剂法与家兔法检测重组人干扰素α2b内毒素结果的相关性,并参照家兔热原试验的阈值量,来确定本制品质量标准中内毒素的限量标准。方法分别用不同浓度的内毒素溶液和含不同浓度内毒素的供试品溶液进行家兔热原质试验,确定供试品内毒素限值,并在此限值下进行内毒素检测,方法均参照2000年版《中国药典》和2000年版《中国生物制品规程》进行。结果在含不同浓度内毒素溶液的家兔热原质试验中,致热阈值小于5.0EUml。在含不同浓度内毒素供试品溶液的家兔热原质试验中,致热阈值小于1.25EUml。以此确定本品内毒素限值,检测该制品的内毒素含量,结果均符合规定。结论本品在内毒素含量小于3.5EU500万单位dose的范围内,根据具体的对照实验及制品的用途来规定细菌内毒素限值,可用鲎试剂法代替家兔法检测注射用重组人干扰素α2b冻干制剂的热原质。     

β-环糊精对曲拉通X-114紫外光谱抗干扰性能的影响

辛基苯基聚氧乙烯醚（曲拉通X-114）和脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO-9）之间的相互作用能对水溶液中曲拉通X-114的紫外光谱产生明显影响。实验结果表明,在200～350nm范围内,曲拉通X-114的最大吸收波长为223nm,AEO-9的紫外吸光度接近于0;在水溶液中,AEO-9能减弱曲拉通X-114的紫外吸光度,降幅达3.4%;AEO-9还能显著降低曲拉通X-114的表观临界胶束浓度（cmc）,当AEO-9的浓度从0增加到0.050mmol/L 和0.100mmol/L时,曲拉通X-114的表观cmc从0.219mmol/L分别降至0.207mmol/L和0.202mmol/L。实验结果进一步表明,β-环糊精（β-CD）能有效降低AEO-9对曲拉通X-114的紫外吸光度及表观cmc的影响,在曲拉通 X-114和AEO-9复配水溶液中,按物质的量比1∶1加入β-CD,复配水溶液中曲拉通X-114的回收率从95.8%～103.3%变化至99.0%～100.1%,表明了β-CD能明显降低AEO-9对曲拉通X-114的干扰作用。红外光谱表征结果（FTIR）、核磁共振氢谱表征（¹H NMR）及热重差热分析表征结果（TG-DSC）表明,曲拉通X-114进入β-CD 分子空腔并形成包结物,是阻断曲拉通X-114分子形成混合胶束以及消除AEO对曲拉通X-114的干扰的主要原因。     

非离子表面活性剂在浊点萃取及光度分析中的应用研究

对浊点萃取以及光度分析中非离子型表面活性剂的增效作用进行研究,通过红外光谱、相对粘度和可见吸收吸分光光度法等方法对表面活性剂聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-114和Triton X-100)进行表征和研究。结果表明,在可见吸收分光光度法中,TX-114比TX-100具有更高的增效作用,能够有效提高有色金属络合物在水中的溶解度和灵敏度;对于浊点萃取过程的增效作用研究表明,TX-114与TX-100相比具有不同的相对粘度,对浊点萃取和光度分析具有显著的差异,相对粘度高的TX-114表现出更高的增效作用,能够提高分析方法中的灵敏度并降低检出下限。     

Simultaneous recombinant 503 antigen recovery and endotoxin removal from E. coli M15 homogenate using expanded bed adsorption chromatography

This study evaluated the simultaneous recovery of recombinant 503 antigen and endotoxin removal from E. coli homogenate by immobilized metal affinity- expanded bed adsorption chromatography (EBAC), using the non-ionic surfactant Triton X-114 during the washing step. The strategy employed was able to remove more than 99% of endotoxin in all conditions tested, and the lowest residual concentration obtained was 10.22 EU/mL, with a recovery of 503 antigen ranging from 41.4% to 61.1%. Therefore, the procedure of integrating the clarification, recovery of protein, and endotoxin removal into a unit operation exploiting the EBAC was successful.     

双水相微胶束萃取对苯二酚研究

采用非离子型表面活性剂辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-114)组成的双水相系统(ATPS)萃取对苯二酚,依据胶束分相和分配,实现对苯二酚的萃取和分离。讨论表面活性剂浓度对萃取率的影响,尝试用反萃取方法回收进入微胶束相的对苯二酚。结果表明:双水相微胶束对对苯二酚的萃取率取决于Triton X-114的浓度,双水相微胶束对对苯二酚的萃取率随Triton X-114浓度的增加而增大;反萃取时溶液的pH值等因素对反萃取率的影响很大,通过调节pH值可以使反萃取率增大。     

A Two-Step Protocol to Remove Endotoxins from Human-Like Collagen

A two-step protocol to remove endotoxins from recombinant human-like collagen was investigated. To meet the clinical need, Triton X-114 two-phase extraction system was applied as the first step to remove large amounts of endotoxins, while affinity chromatography was used as the second step to achieve further purification. Under the best experimental condition optimized through response surface methodology techniques, endotoxin level was 0.025?0.25 EU/mg and protein recovery was 81.9%, respectively, which indicated that 99% of endotoxins were eliminated with high protein recovery. Therefore, the two-step protocol can be exploited as an efficient method for endotoxin elimination in biotechnology processes.     

流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化

目的优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速离心的纯化效果,以及TritonX-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果层析法纯度稍高于蔗糖密度梯度超速离心法,而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。TritonX-100的裂解效果优于去氧胆酸钠,裂解剂浓度为0.5%或0.8%,裂解3或4h,裂解率达90%以上。疫苗在4℃保存1年后,所有检测项目均合格,4℃保存18个月和37℃保存28d后,HA含量仍保持在30μg/ml以上。结论已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。     

亲和胶质气体泡沫的制备及其对胰蛋白酶的吸附分离特性

Triton X-114, an non-ionic surfactant, was modified with the affinity ligand of trypsin, paminobenzamidine (PAB) and the affinity surfactant (PAB-TX) was synthesized. Then, the affinity surfactant was used to prepare affinity-based colloidal gas aphrons (CGA). The stability of the affinity CGA was investigated at different temperatures and compared with that of the CGA prepared from Triton X-114. Compared with the CGA from Triton X-114, the affinity CGA showed high selective adsorption property for trypsin. In the separation of a protein mixture, recovery yield higher than 74% were achieved for trypsin and the separation factor reached over 1.5. The results showed that the affinity CGA possessed promising selectivity for separating trypsin from a protein mixture.