结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。方法将ESAT-6基因自pET-24b-ESAT-6质粒亚克隆至pGEX-3C载体中,构建重组表达质粒pGEX-ESAT-6,经酶切及测序鉴定正确后,分别转化大肠杆菌JM107和BL21(DE3),以不同浓度IPTG诱导表达,表达产物经GSH-Sepharose4 B亲和层析纯化。结果所构建的重组表达质粒pGEX-ESAT-6经酶切及测序鉴定正确;重组融合蛋白在大肠杆菌JM107中的表达量较高,可达菌体总蛋白的24.2%;最适IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;纯化的目的蛋白纯度可达83.9%。结论已成功构建了重组表达质粒pGEX-ESAT-6,并在大肠杆菌JM107中高效表达,为结核分枝杆菌亚单位疫苗及核酸疫苗的研制提供了材料。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

以结核分枝杆菌38kD重组蛋白为抗原的血清学诊断

目的克隆表达结核分枝杆菌38kD抗原基因,并以此蛋白为抗原,进行分枝杆菌的血清学诊断。方法采用PCR自结核分枝杆菌基因组DNA中扩增38kD抗原基因,经测序鉴定正确后,克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,经ELISA检测其抗原的灵敏度与特异性。结果目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的28%,ELISA检测灵敏度为79.8%,特异性为99.0%。结论重组38kD抗原可用于结核分枝杆菌的诊断。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1基因的原核表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1(ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1,ClpP1)基因重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中PCR扩增ClpP1基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,转化大肠埃希菌B21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约35 000,可与鼠抗His单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpP1蛋白在MTB中的生物学特性奠定了基础。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础。     

梅毒螺旋体-15脂蛋白的原核表达及其纯化

目的原核表达梅毒螺旋体-15(Treponema pallidum-15,TP-15)脂蛋白基因,并进行纯化及鉴定。方法人工合成455 bp的TP-15基因序列,克隆至原核表达载体p ETDuet-1,构建原核表达质粒p ETDuet-1/TP-15,经双酶切及测序鉴定后,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达;表达产物经Ni2+亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p ETDuet-1/TP-15经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约27 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的2.34%,纯化后蛋白纯度达99%以上,可与HRP标记的梅毒螺旋体多克隆抗体发生特异性结合。结论构建了原核表达质粒p ETDuet-1/TP-15,并于E.coli中成功表达,纯化后获得了高纯度的TP-15蛋白,为进一步研究建立梅毒病人血清检测试剂盒奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

牛布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白。方法提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物。结果所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确。重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应。结论已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础。     

猪白细胞介素-2基因的原核表达、纯化及其生物学活性

目的原核表达、纯化猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),并检测其生物学活性。方法以提取的猪外周血淋巴细胞基因组RNA为模板,PCR扩增猪IL-2基因,插入原核表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/IL-2。将重组表达质粒转化感受态大肠埃希菌DH5α,经含Amp的LB平板筛选后,将重组菌于LB培养液中培养,分别于不同培养时间进行活菌计数,绘制重组菌的生长曲线;42℃诱导表达重组蛋白,经尿素纯化后,采用CTLL细胞/MTT比色法检测其生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;重组菌的最佳开始诱导时间为重组菌发酵培养10 h;重组蛋白相对分子质量约17 400,表达量占菌体总蛋白的19%,纯化后纯度达95%;重组蛋白的生物学活性可达3×105IU/ml。结论原核表达并纯化了具有生物学活性的重组猪IL-2蛋白,为其进一步研究和产业化生产奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6重组二聚体的表达、纯化及其在血清学诊断中的初步应用

目的表达和纯化结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),并探讨其在结核病血清学诊断中的价值。方法以HG856A核酸疫苗质粒为模板,经PCR扩增获得2×esat-6基因,克隆至pET-28a质粒,构建原核表达质粒pET2E6;转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;用Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白,并用Western blot鉴定其反应原性,ELISA检测其敏感性和特异性。结果ESAT-6重组二聚体以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35%;纯化的rdESAT-6纯度可达95%,可与ESAT-6小鼠抗血清发生特异性反应;用于结核病血清学诊断的敏感性为30%,特异性为95.8%。结论已成功表达并纯化了rdESAT-6,可作为结核病血清学诊断或皮试检测用的抗原之一。     

人心肌肌酸激酶MB同工酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人心肌肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)。方法分别从含CK-M、CK-B基因片段的质粒SC319293和SC119007中扩增CK-M、CK-B基因,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,经GST亲和层析柱纯化后,ELISA法检测其抗原性。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组CK-MB蛋白相对分子质量约110 000,表达量占菌体总蛋白的57%,主要以包涵体形式存在;纯化的CK-MB蛋白纯度大于90%,可与兔抗CK-B、CK-M多克隆抗体特异性结合。结论成功原核表达并纯化了重组CK-MB蛋白,为其大量生产奠定了基础。     

重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组人抗缪勒管激素(human anti-Müllerian hormone,hAMH)C-末端蛋白,并进行纯化。方法 PCR法扩增hAMH C-末端蛋白基因,插入至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-hAMH C。重组质粒转化感受态E. coli BL21(DE3),终浓度为1. 0 mmol/L的IPTG诱导表达h AMH C-末端蛋白。扩大培养后进行Ni亲和层析柱纯化,12%SDS-PAGE分析纯化产物。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pET-28a-hAMH C构建正确。表达及纯化产物均可见相对分子质量约12 500的目的蛋白条带,纯度达90%以上。结论原核表达了重组hAMH C-末端蛋白,纯化后获得了较高纯度的目的蛋白。     

牛种布鲁菌VirB12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛种布鲁菌(Brucella)VirB12蛋白。方法利用PCR法从牛种布鲁菌基因组中扩增VirB12基因,插入pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pETV12,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经组氨酸结合树脂柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果重组表达质粒pETV12经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约22 000,纯化的重组蛋白纯度达94%,可被布鲁菌免疫兔血清特异性识别。结论原核表达并纯化了牛种布鲁菌VirB12蛋白,为进一步研究VirB12蛋白的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv株PE＿PGRS35蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析

目的 克隆结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）PE＿PGRS35基因，构建pET28a-PE＿PGRS35重组表达载体，异源表达并纯化MTB H37Rv的PE＿PGRS35蛋白，经生物信息学分析后，探讨抗MTB新型靶点。方法 PCR扩增PE＿PGRS35编码基因，利用重组克隆技术，构建表达载体pET28a-PE＿PGRS35，测序鉴定成功后转化至大肠埃希菌（E. coli）BL21(DE3)中，加入异丙基-β-D半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。用Ni柱亲和层析纯化PE＿PGRS35蛋白，并对其进行生物信息学分析。结果 经测序证明pET28a-PE＿PGRS35表达载体构建正确，表达的PE＿PGRS35蛋白相对分子质量约53 000，主要以包涵体形式存在，纯度达90%。生物信息学分析表明，PE＿PGRS35蛋白为酸性不稳定性蛋白，主要二级结构为β-折叠和无规则卷曲，无跨膜区，推测为膜外蛋白，有39个磷酸化位点和2个保守结构域，有Rv1769、PPE8、PPE64、PPE54、PPE24、PPE16、PPE35、PPE6、PPE28、PE2共10个...     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

人星状病毒非结构蛋白nsP1a/3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体。方法酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,并优化表达条件。表达的重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后,经腹腔免疫SD大鼠,共4次,最后1次免疫7 d后,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测多抗效价,Western blot鉴定多抗的特异性。结果重组表达质粒nsP1a/3-pET-28a经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为22500,以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度为86.6%,浓度为1.26mg/ml;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶30 000,且特异性较好。结论成功地原核表达、纯化了HAstV非结构蛋白nsP1a/3,并制备了特异性良好的鼠多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白在病毒侵染靶细胞时的作用机制奠定了基础。     

寨卡病毒E蛋白第三结构域的可溶性表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化寨卡病毒(Zika virus)E蛋白第三结构域(ZK-EⅢ)重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增ZK-E Ⅲ序列,经双酶切后将其插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-ZKE Ⅲ,转化至大肠埃希菌(E. coli)Rosetta2(DE3),经IPTG诱导,表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备ZK-E Ⅲ多克隆抗血清,进行Western blot鉴定后,ELISA法检测该抗血清效价。结果经PCR及测序鉴定证明原核表达质粒pET-ZKE Ⅲ构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约31 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的60%;用纯化的重组蛋白免疫家兔后,获得的血清特异性良好,血清效价为1∶51 200。结论 ZKE Ⅲ蛋白在E. coli中以可溶性形式表达,制备的抗血清特异性好,效价高,具有用于寨卡病毒诊断和进行重组亚单位疫苗开发的潜力。     

基孔肯雅病毒E2蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础。方法根据Gen Bank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物并以合成的E2基因为模板,PCR扩增CHIKV E2,连接到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后进行纯化。结果重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2经双酶切鉴定构建正确,测序结果与原序列一致。表达的CHIKV E2融合蛋白相对分子质量约为47 000,可与His标签抗体特异性结合,纯化后纯度达95%以上。结论成功在大肠埃希菌中表达了CHIKV E2蛋白,纯化后蛋白纯度较高,为CHIKV亚单位疫苗的免疫试验奠定了基础。