以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株,为以Vero细胞为基质生产流感疫苗奠定基础。方法以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)为母本株,与WHO推荐的2007～2008年度北半球流感疫苗生产用毒株A/Caledonia/20/99(H1N1)共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)抗体筛选重配病毒,在Vero细胞连续传12代,采用血凝抑制试验和RT-PCR鉴定病毒型别。将重配病毒经Vero细胞大量培养,重配前的病毒经鸡胚大量培养,分别经甲醛灭活,制备灭活疫苗,免疫ICR小鼠,检测其免疫原性。结果获得了1株Vero细胞适应的高产H1N1流感病毒株,连续传9代后,病毒血凝滴度维持在512,免疫原性与重配前的毒株相比,差异无统计学意义。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H1N1流感病毒Vero细胞适应株。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。     

Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选

目的筛选Vero细胞生长的最适低血清培养基,用于流感病毒的细胞培养。方法分别以MEM、M199、DMEM/F12、DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加5%、2%、1%的小牛血清传代培养Vero细胞,通过细胞形态观察、细胞计数及MTT法检测细胞的增殖活力筛选最适基础培养基;将流感病毒接种低血清适应的Vero细胞,检测病毒收获液的血凝效价及残留BSA含量,电子显微镜观察病毒形态。结果以DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加2%小牛血清培养的Vero细胞长势良好,细胞数量较多,增殖活力最强。低血清适应的Vero细胞培养的流感病毒血凝效价最高可达1∶512,平均值为1∶384;病毒液中的残留BSA含量约为正常血清培养条件下的1/18;病毒形态完整。结论成功筛选出Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基,为更具生物安全性的流感疫苗的研发奠定了基础。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10~4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10~4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

Vero细胞制备流感病毒疫苗

目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素(HA)滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制(HI)试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为:维持液中胰酶浓度12.5～15μg/ml,pH值7.4～7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72～96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。     

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL~(TM) VERO、Virus Pro ~(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。