优化I型胶原蛋白的纯化工艺

本文使用0.5mol/L乙酸和胃蛋白酶提取I型胶原蛋白后，结合等电点沉淀法和超滤纯化技术对I型胶原蛋白进行纯化。通过鞣酸沉淀法和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证实等电点沉淀可有效除去胃蛋白酶；经超滤纯化后的胶原蛋白紫外光谱检测在235nm处有最大吸收峰；在SDS-PAGE谱图上出现3条I型胶原蛋白特征谱带；采用凯氏定氮法也证实其纯度符合YY/T 1511-2017医药行业标准；通过傅里叶变换红外光谱、圆二色谱法(Circular Dichroism, CD)测定证实胶原蛋白三螺旋结构被完整保留下来。采用等电点沉淀法结合超滤纯化技术，可保证I型胶原蛋白的高纯度及三螺旋结构的完整性。     

1～100kDalton的胶原水解物的分子量分布测定的研究

采用凝胶板配方和电泳条件优化后的SDS-PAGE技术对酸法明胶水解物、碱法明胶水解物、胃蛋白酶法明胶水解物、胃蛋白酶法猪皮胶原水解物、明胶以及猪皮胶原蛋白透析物等进行表征,获得了将分布于一块凝胶板上的1～100kD的棒状胶原蛋白各组分的色谱图。胃蛋白酶法猪皮胶原蛋白水解物经电泳分离后的色谱图中,各谱带清晰明显,分子量均一,且均匀分布于1～100kD不等,这对棒状胶原蛋白分子的研究具有重要价值。     

胃蛋白酶提取牛皮胶原蛋白的工艺研究

以新鲜牛皮为原料,分析了牛皮的基本组成;采用胃蛋白酶提取牛皮胶原蛋白,研究了提取过程中加酶量、提取温度、提取时间和料液比对胶原蛋白提取率的影响,得到酸酶结合法提取牛皮中胶原蛋白的最佳工艺条件为:以0.5 mol/L乙酸作提取剂,每1 g牛皮加入30 mL浸提液(即料液比1∶30),胃蛋白酶加入量3 000 U/g牛皮,提取温度30℃,提取时间为8 h,在该条件下胶原蛋白的提取率为61.7%。提取的胶原蛋白经过初步纯化后进行紫外扫描,测得其最大紫外吸收波长为232 nm,与Sigma标准Ⅰ型胶原蛋白一致。     

鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定

目的探讨可溶性Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)的提纯方法。方法以雏鸡胸软骨为原材料,酸性条件下经胃蛋白酶消化,离心后,应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,透析,盐析,得到纯化的CⅡ。结果自提的CⅡ样品与CⅡ标准品采用SDS-PAGE电泳显示条带一致。结论本法提纯CⅡ具有材料丰富,操作简便,重复性好等优点。     

酸酶结合法提取牛皮胶原蛋白的工艺研究

以新鲜牛皮为原料,分析了牛皮的基本组成;采用胃蛋白酶提取牛皮胶原蛋白,研究了提取过程中加酶量、提取温度、提取时间和料液比对胶原蛋白提取率的影响,得到酸酶结合法提取牛皮中胶原蛋白的最佳工艺条件为：以0.5 mol／L乙酸作为提取剂,料液比为1：30,胃蛋白酶加入量3 000 U／g牛皮,提取温度35℃,提取时间为8 h,在此条件下得胶原蛋白的提取率为61.7％。提取的胶原蛋白经过初步纯化后进行紫外扫描,测得其最大紫外吸收波长为232nm,与sigma标准Ⅰ型胶原蛋白一致。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

重组人干扰素β1a的纯化及其理化性质

目的纯化重组人干扰素β1a(recombinant human interferonβ1a,rhIFNβ1a),并分析其理化性质。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体培养表达rhIFNβ1a的重组CHO细胞,细胞培养收获液经超滤浓缩、蓝胶亲和层析、脱盐和CM离子交换层析纯化后,采用水泡性口炎病毒抑制法测定rhIFNβ1a的效价;Lowry法测定蛋白含量;等电聚焦电泳法测定其等电点;SDS-PAGE和高效液相色谱法测定其纯度;Western blot法分析其免疫活性;SDS-PAGE和质谱仪测定其相对分子质量;圆二色谱法分析其二级结构。结果共纯化了3批样品,纯化的rhIFNβ1a平均蛋白浓度为0.284 0 mg/ml,平均比活可达1.06×108IU/mg,纯度达95%以上,蛋白质平均回收率为58.36%,蛋白质相对分子质量为20 445.0,等电点约为6.6,免疫活性良好,二级结构与国家标准品基本一致。结论成功纯化了rhIFNβ1a,并检测了其理化性质,为建立大规模制备rhIFNβ1a的生产工艺和制造检定规程,实现产业化奠定了基础。     

驴皮中胶原蛋白的提取及其特性研究

分别采用酸法和酶法提取驴皮胶原蛋白,并测定了所提取胶原蛋白的性质。结果表明,两种方法提取的胶原蛋白紫外最大吸收峰都在234 nm处,在280 nm处吸收较小;两者红外吸收光谱相似,并且都具有三股螺旋结构;电泳图谱分析所得胶原蛋白的亚基组成形式为(α1)2α2,推测所提取的是Ⅰ型胶原蛋白;DSC(示差量热扫描法)测定发现,酶溶性胶原蛋白的热收缩温度(65.33℃)高于酸溶性胶原蛋白(50.90℃);羟脯氨酸测定发现,酶法提取驴皮胶原蛋白的纯度高于酸法提取驴皮胶原蛋白的纯度。     

蛋壳膜中提取出的胶原蛋白的表征

胶原蛋白可以用酸性胃蛋白酶消化的方法从蛋壳膜中提取,并且用盐沉淀方法分离出来。蛋壳膜胶原蛋白的特性用氨基酸分析、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、傅里叶变换红外(FTIR)光谱和差示扫描量热术等方法进行研究。蛋壳膜胶原蛋白的氨基酸组成中有大量的氨基乙酸、脯氨酸和羟基脯氨酸。电泳显示出两种不同的α(α1和α2)链,FTIR红外显示出酰胺A,B,Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ各自在3325,2926,1653,1550和1240cm-1区域。差示扫描量热术的分析显示蛋壳膜胶原蛋白的热变性温度是55.10℃,在提取后蛋壳膜中胶原蛋白保持着分子间的交联。蛋壳膜中的胶原蛋白是典型的Ⅰ型胶原蛋白,它可能适合于多种应用,包括功能食品、化妆品、生物医药和制药工业等。     

栝楼籽蛋白分离纯化及抗氧化性的研究

采用超声波辅助碱溶法提取栝楼籽蛋白,以等电点沉淀、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀等三种方法对栝楼籽蛋白纯化,并对纯化蛋白分别进行羟基自由基清除能力,DPPH自由基清除能力,铁还原能力的测定。结果表明,在三种纯化方法的最优条件下,蛋白质析出率最高的为硫酸铵沉淀法,其次为等电点沉淀法,较小的为乙醇沉淀法;三种方法沉淀蛋白质的抗氧化性均随着蛋白质浓度增大而增强,但它们的抗氧化能力不一,抗氧化能力强弱顺序为:硫酸铵沉淀等电点沉淀乙醇沉淀。     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的纯化及其免疫原性

目的纯化不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)外膜蛋白P6,并检测其免疫原性。方法常规培养NTHi,根据外膜蛋白P6的特性纯化P6蛋白。Lowry法测定纯化P6蛋白的含量;SDS-PAGE检测纯化P6蛋白的相对分子质量及纯度;IEF-PAGE分析纯化P6蛋白的等电点;琼脂糖双向免疫扩散试验鉴定纯化P6蛋白;以纯化的P6蛋白免疫NIH小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平,并进行小鼠保护性试验。结果纯化的P6蛋白含量为208μg/ml;相对分子质量为16600,纯度为100%;等电点为5.49;琼脂糖双向免疫扩散试验证实所提取的蛋白为P6蛋白;ELISA检测显示,P6蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够诱导产生针对P6蛋白的抗体,其抗体水平呈剂量依赖关系,最佳免疫剂量为10μg/只,最佳免疫针次为3针;对20LD50NTHiSSIp/1225株攻击的小鼠保护率为80%。结论已纯化了不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6,其具有良好的免疫原性和保护效果。     

栝楼籽蛋白分离纯化及抗氧化性的研究

采用超声波辅助碱溶法提取栝楼籽蛋白,以等电点沉淀、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀等三种方法对栝楼籽蛋白纯化,并对纯化蛋白分别进行羟基自由基清除能力,DPPH自由基清除能力,铁还原能力的测定。结果表明,在三种纯化方法的最优条件下,蛋白质析出率最高的为硫酸铵沉淀法,其次为等电点沉淀法,较小的为乙醇沉淀法;三种方法沉淀蛋白质的抗氧化性均随着蛋白质浓度增大而增强,但它们的抗氧化能力不一,抗氧化能力强弱顺序为:硫酸铵沉淀>等电点沉淀>乙醇沉淀。     

乳癌组织中人类表皮生长因子受体2蛋白的纯化及鉴定

目的建立乳腺癌组织中人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)蛋白的纯化方法。方法采用新鲜的乳腺癌组织制备匀浆液,经60%饱和硫酸铵盐析沉淀法进行乳腺癌组织蛋白的粗提;再通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和两次Sephacryl S-200分子筛层析进一步纯化HER2蛋白;纯化蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果纯化后HER2蛋白相对分子质量为185 000;HER2蛋白可与兔抗人HER2多克隆抗体发生特异性结合。结论建立的纯化方法获得了具有免疫学活性的HER2蛋白,为HER2单克隆抗体的制备奠定了基础。     

重组人血清白蛋白-干扰素β融合蛋白的分离纯化及质控方法的建立

目的建立中试制备重组人血清白蛋白-干扰素β(Recombinant human serum albumin-interferonβ,rHSA-IFNβ)融合蛋白的纯化工艺及质控方法。方法采用50 L发酵罐诱导表达rHSA-IFNβ融合蛋白,发酵液经超滤浓缩及脱盐后,再经BlueSepharose FF亲和层析、G25凝胶过滤层析和SP Sepharose FF阳离子交换层析纯化。SDS-PAGE(银染法)和HPLC测定融合蛋白纯度,Western blot分析反应原性,质谱法测定相对分子质量,Edman降解法测定N-末端氨基酸序列,等电聚焦电泳法测定等电点,细胞病变抑制法测定rHSA-IFNβ融合蛋白的生物学活性,其余检测项目均按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果纯化的3批融合蛋白纯度可达96%以上,具有人血清白蛋白和人干扰素β的双重反应原性,相对分子质量分别为89 070、89 035和88 669,N-末端氨基酸序列为:NH2-D-A-H-K-S,等电点为6.34,比活性分别为1.9×106、1.5×106和1.1×106IU/mg,其余各项指标均符合要求。结论已成功建立了中试制备rHSA-IFNβ融合蛋白的纯化工艺及质控方法。     

牦牛皮胶原蛋白的提取及其性能分析

以牦牛皮为原料,提取了酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对胶原蛋白分子的结构和性能进行了分析。结果表明:ASC和PSC的提取率分别为54%±0.18%和78%±0.42%;UV、FTIR及电泳分析结果表明:ASC和PSC具有完整的三股螺旋结构,符合Ⅰ型胶原蛋白的结构特征;氨基酸分析发现:ASC和PSC含有丰富的亚氨基酸,其含量分别为264.1和276.6残基/1000残基;热稳定性分析表明:ASC和PSC热变性温度(Td)分别为37.5、41.5℃,热收缩温度分别为62.5、70.0℃,证明PSC的热稳定性高于ASC;SEM结果表明:ASC和PSC表面为松散、不规则的纤维网形态;自组装实验结果显示:两者具有一定的成纤维能力,自组装产物的D-周期分别为(68.2±5)nm、(69.3±3)nm,且PSC比ASC的组装速度快。     

氯仿抽提纯化CA 16病毒最优条件的筛选

目的筛选氯仿抽提纯化柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CA16)的最优条件。方法根据《中国药典》三部(2015版)的相关要求,选择病毒感染性滴度、残余蛋白、残余牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、残余卡那霉素及残余氯仿含量等指标,分析氯仿抽提的不同条件及超滤浓缩对纯化产物质量指标的影响。将CA16浓缩病毒液与氯仿按不同体积比进行一抽多洗纯化,分析不同比例氯仿对纯化效果的影响;将CA16超滤浓缩病毒液分别用不同浓度的PBS洗涤,以评价不同离子浓度的PBS洗涤对纯化病毒纯化液质量指标的影响。结果不同浓度的PBS洗涤液、病毒液与氯仿体积比对纯化液病毒感染性滴度均无明显影响,病毒回收率平均为81.7%;随着PBS洗涤次数的增多,洗液中的杂蛋白逐渐减少,氯仿比例及PBS离子浓度对蛋白去除率影响不明显,蛋白去除率均大于82%(82.69%~93.6%),平均去除率88.37%;不同氯仿比例、不同PBS浓度及不同洗涤次数对残余卡那霉素含量无明显影响,结果均低于30 ng/mL,经超滤浓缩后,其含量低于3.0 ng/mL;氯仿抽提纯化残余BSA的去除率可达68.87%,若结合超滤浓缩工艺,残余BSA的去除率可达94.74%;超滤浓缩后纯化病毒液残余氯仿去除率可达98%以上,最终纯化液残余氯仿含量小于6μg/mL。结论氯仿抽提方法结合超滤浓缩可得到符合要求的CA16病毒实验性疫苗。     

牦牛皮胶原蛋白的提取及性能分析

以牦牛皮为原料,提取了酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对胶原蛋白分子的结构和性能进行了分析。结果表明:ASC和PSC的提取率分别为54%±0.18%和78%±0.42%;UV、FTIR及电泳分析结果表明:ASC和PSC具有完整的三股螺旋结构,符合Ⅰ型胶原蛋白的结构特征;氨基酸分析发现:ASC和PSC含有丰富的亚氨基酸,其含量分别为264.1和276.6残基/1000残基;热稳定性分析表明:ASC和PSC热变性温度(Td)分别为37.5、41.5℃,热收缩温度分别为62.5、70.0℃,证明PSC的热稳定性高于ASC;SEM结果表明:ASC和PSC表面为松散、不规则的纤维网形态;自组装实验结果显示:两者具有一定的成纤维能力,自组装产物的D-周期分别为(68.2±5)nm、(69.3±3)nm,且PSC比ASC的组装速度快。     

TiO2/CTS/ATP吸附联合超滤工艺去除腐殖酸的研究

以酸化凹土(ATP)作载体制备壳聚糖/凹土(CTS/ATP),再采用溶胶-凝胶法负载Ti O_2制得Ti O_2/CTS/ATP。研究表明,Ti O_2/CTS/ATP等电点(pH=6.28)比ATP等电点(pH=2.55)高,更易达到最佳pH条件;比表面积和孔隙体积相比ATP增大,吸附容量提高。在pH为3～10,Ti O_2/CTS/ATP投加量为1.0 g/L条件下,对水中腐殖酸具有较好的吸附效果。相比单独吸附和超滤,采用吸附联合超滤去除腐殖酸效果更佳。吸附联合超滤既能减轻超滤膜负荷,又可缓解膜污染。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gC2蛋白在CHO细胞中的表达、纯化及其免疫活性

目的在CHO细胞中表达单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)Ⅱ型gC2蛋白,纯化后检测其免疫活性。方法利用ANTHEWIN等软件分析GenBank中HSVⅡ型gC2的氨基酸序列,筛选抗原表位富集、且亲水性较好的蛋白胞外区片段,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,通过OptimumGene软件对基因进行序列优化,化学合成全新的基因序列HSV2-gC2,PCR扩增后,插入pMCE5载体,构建重组表达质粒pMCE5-gC2,转染至CHO细胞中进行真核表达。表达的重组gC2蛋白经亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的重组gC2蛋白分别于第0、2、4周经腹腔免疫小鼠,以免疫PBS作为对照,采用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ(代表Th1细胞因子)和IL-4(代表Th2细胞因子)的细胞频率。结果重组表达质粒pMCE5-gC2经菌落PCR、双酶切(EcoRⅠ/NotⅠ)及测序证实构建正确;纯化的重组gC2蛋白相对分子质量约为90 000,纯度约为85%,浓度为40μg/ml,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;通过3次免疫,小鼠产生了高水平的血清抗体,与免疫前相比,差异均有统计学意义(P0.001);免疫小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后,分泌IFNγ和IL-4的细胞频率分别为(13.46±2.832)/106和(19.2±2.48)/106个细胞,均显著高于对照组(P0.001)。结论在CHO细胞中表达了重组gC2蛋白,纯化的蛋白能够激发小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制HSV亚单位疫苗奠定了基础。     

猪皮胶原的降解

采用低温-胃蛋白酶法从新鲜猪皮中提取胶原。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）结合紫外、红外光谱分析证明所提取的胶原为Ⅰ型活性胶原,即胶原分子量约为32万道尔顿,组成为α1）2α2,且具有完整的三股螺旋结构;利用天然胶原的特性降解酶细菌胶原酶进行低温降解,得到分子量在3万到20万道尔顿之间的降解产物,降解产物红外光谱证明大部分仍然保持三股螺旋结构,并与市售的胶原多肽（失活）的红外光谱图比较,充分体现了此降解方案的优越性。