大规模纯化脊髓灰质炎病毒的蔗糖垫层离心法的建立

目的建立可大规模纯化脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)的蔗糖垫层离心法。方法病毒大量增殖后,收集病毒液,经PEG浓缩、三氟三氯乙烷抽提后,采用蔗糖垫层或Cs Cl密度梯度离心法纯化PV(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),电镜下观察病毒形态,进行核酸及感染性滴度的检测。将纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV免疫豚鼠,心脏采血,分离血清,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果蔗糖垫层离心法纯化的各型PV,病毒颗粒形态典型,背景清晰,除完整的光滑型病毒颗粒外,还可见大量空心病毒颗粒样品,纯化效果较好;Cs Cl密度梯度离心法纯化的PV样品,病毒形态也较典型,但完整的病毒颗粒较多。两种纯化方法获得的病毒基因组核酸特征显著,背景清晰,无明显差异。蔗糖垫层离心法纯化的各型PV的感染性滴度及免疫后豚鼠血清中和抗体滴度均高于Cs Cl密度梯度离心法。结论蔗糖垫层离心法纯化的PV纯度高,免疫原性好,可用于大规模纯化PV或其他病毒。     

脊髓灰质炎病毒颗粒分离纯化方法学评价

目的比较3种不同密度梯度离心方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。方法选择蔗糖密度梯度离心、氯化铯密度梯度离心、Optiprep(碘克沙醇溶液)密度梯度离心方法,对脊髓灰质炎病毒进行纯化,抽取离心之后的蛋白条带,通过计算蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒颗粒透射电镜观察,评价其对病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。结果病毒液经蔗糖、氯化铯和Optiprep 3种介质超速离心,均能分离空心颗粒和实心颗粒。氯化铯密度梯度离心法蛋白回收率优于Optiprep及蔗糖密度梯度离心法;Optiprep密度梯度离心法蛋白纯度优于氯化铯及蔗糖密度梯度离心法。结论通过蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒颗粒透射电镜观察初步评价了3种方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒和实心颗粒的分离效果,为脊髓灰质炎病毒分离纯化提供了参考。     

不同形式脊髓灰质炎病毒颗粒的免疫原性

目的评价不同形式的脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)颗粒的免疫原性。方法采用蔗糖密度梯度超速离心法分别将经56℃加热1.5 h处理和未经加热的PV进行分离纯化,收集相应组分,进行电镜观察及SDS-PAGE分析,并测定各组分的D抗原及蛋白含量。用不同PV颗粒组分分别免疫大鼠,均经腿部肌肉注射,共接种3次,每次间隔21 d,于免疫前和第1、2次免疫后21 d经眼眶采血,末次免疫后21 d经心脏穿刺采血,分离血清,微量细胞病变(CPE)抑制法检测血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV中和抗体几何平均滴度(GMT)。结果未经加热处理的PV可分离获得EP(蔗糖浓度16%~19%)和FP(蔗糖浓度22%~24.5%)两种病毒颗粒,电镜观察分别为空心颗粒和实心颗粒,EP经SDS-PAGE分析可见VP0、VP1和VP3病毒蛋白条带,FP可见VP1、VP2、VP3和VP4条带;经56℃加热处理的PV可分离获得HP(蔗糖浓度15%~17%)一种病毒颗粒,电镜观察为空心颗粒,SDS-PAGE分析可见VP0、VP1、VP2、VP3病毒蛋白条带。EP、FP免疫大鼠后,均可诱导产生针对PV的中和抗体,但EP诱导产生的中和抗体GMT低于FP;HP不能诱导产生中和抗体。结论未经加热的PV可分离获得EP和FP两种病毒颗粒,均具有免疫原性;经加热处理的PV仅分离获得HP一种病毒颗粒,不具有免疫原性。     

HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化

目的制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定。方法采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体p CI-HBSE1、p CI-HBSE2、p CI-HBSE3、p CI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBs Ag定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应。结果电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度最高的VLPs-SE2 HBs Ag含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平。结论成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础。     

呈现埃博拉病毒包膜糖蛋白抗原表位重组病毒样颗粒的构建

目的构建呈现埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原表位的病毒样颗粒(viruslike particles,VLPs)。方法通过EBOV GP抗原性预测,并结合其功能结构域分析获得潜在的B细胞表位,经基因重组将该抗原表位插入至乙肝核心抗原(HBcAg)的优势表位区域,SDS-PAGE法分析重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的表达。重组菌体破碎上清经硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心纯化后,通过电镜观察VLPs形态。将VLPs与Alum佐剂按1∶1的比例混合,经背部皮下免疫小鼠。ELISA及Western blot法检测小鼠血清的特异性。结果重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的相对分子质量约19 300,纯化后蛋白浓度为1.244 mg/ml,镜下可见其以VLPs形式存在。VLPs免疫小鼠血清可与GP发生特异性免疫反应。结论成功构建了呈现EBOV GP抗原表位的VLPs,其可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。本实验为EBOV基因重组疫苗的研究及特异性抗体的制备奠定了基础。     

蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量(600、700和800 ml)时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间(2、3和4 h)条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。     

EV71两种结构形式的免疫学特性比较

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在病毒增殖的动力学过程中不同时间点的病毒样品所具有的两种结构形式及免疫学特性,为疫苗的研发及质控提供参考。方法利用Opti Prep密度梯度离心获得EV71两种结构形式,电镜扫描观察两种结构形式的颗粒形态;采用病毒微量滴定法测定病毒两种结构形式的感染性滴度;EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫(BA-ELISA)方法测定病毒两种结构形式的抗原含量;QRT-PCR法测定两种结构形式的病毒RNA含量;SDS-PAGE及Western blot鉴定病毒两种结构形式。将分离得到的空壳及实心病毒颗粒成分用甲醛灭活后,与Al(OH)3佐剂混合,对小鼠进行皮下多点注射,分别于初免28 d及二免7、14 d,经小鼠尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验法检测抗EV71中和抗体;将二免14 d后的雄、雌鼠合笼,生产后24 h内,用EV71FY-23对乳鼠进行颅内注射,10 d内观察乳鼠存活率。结果经Opti Prep密度梯度离心后,可获得两条沉降系数不同的病毒条带,位于上层的病毒结构成份基本以空心衣壳颗粒形式存在;下层病毒结构成分在感染前期主要为以实心颗粒形式存在,感染后期则以空壳和实心颗粒同时存在,两种结构形式均能被抗EV71特异血清识别。在病毒感染过程中,下层毒粒感染性滴度均比上层毒粒高2~3个log值;两种结构形式的抗原滴度均呈增加的趋势,但下层毒粒抗原滴度增加更为明显;病毒两种结构形式两层的RNA含量不同,下层毒粒中VP0均已裂解形成VP2和VP4,而上层毒粒中以VP0为主要成分。初免后28 d及二免后7、14 d,两种结构形式的EV71均诱导小鼠抗体阳转,但上层毒粒诱导的中和抗体效价及增长速度均明显低于下层毒粒(P均0.001)。病毒两种结构形式免疫小鼠产生的乳鼠免疫保护效率均为100%。结论 EV71的两种结构形式虽然具有差异,但作为病毒疫苗抗原用于免疫时,均具有免疫学意义。     

sIPV疫苗D抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立牛多抗对兔多抗夹心ELISA方法 检测Sabin株脊灰病毒灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus Vaccine,sIPV)D抗原含量,并对建立的方法 进行验证。方法 分别采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sIPV疫苗原液作为抗原制备兔多抗,并通过间接ELISA法检测其效价及特异性。以牛多抗为包被抗体、兔多抗为显示抗体建立检测D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法 ,并对方法 的准确度、精密度及D抗原专属性进行验证。用建立的方法 检测国内5家企业sIPV疫苗样品。结果 制备获得型别特异性好、效价高的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔多抗,并成功建立了双抗体夹心ELISA方法 。采用四参数拟合,3型别标准曲线均具有良好的线性关系,R²均>0.99。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各试验加标回收率均为80%～120%,各浓度平均回收率分别为98.11%、97.41%、98.66%;重复性与中间精密度CV均<10%;能够对D/C抗原进行区分。建立的方法 对5家企业生产的sIPV疫苗均能够进行D抗原定量检测。结论 成功建立了检测sIPV疫苗D抗原含量的双抗体夹心ELI...     

甲型肝炎病毒抗原定量参比品的研制

目的制备甲型肝炎病毒抗原定量参比品。方法依据《甲型肝炎灭活疫苗制造及检定规程》制备了1批甲肝病毒抗原参比品,并进行蛋白质含量测定、HAV蛋白纯度分析和酶标抗原含量标化。结果经纯化,杂蛋白去除率达99.9%,参比品的纯度大于95%;抗原含量在20~80 EU/ml范围内,抗原含量的对数与其A值呈剂量-效应关系。结论该参比品可用于甲肝病毒ELISA定性及定量标定。     

两种方法纯化流感病毒的比较

目的比较两种方法纯化流感病毒的效果。方法取病毒原液,经超滤浓缩后,分别用Sepharose 4FF凝胶层析和蔗糖密度梯度离心法进行纯化,并对纯化产物进行检定。结果层析法的纯度、卵清蛋白及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法。结论两种方法均可用于流感病毒的纯化。     

GⅡ.4诺如病毒抗原ELISA定量检测方法的建立及其应用

目的建立GⅡ.4诺如病毒(Norovirus,No V)抗原ELISA定量检测方法,用于重组GⅡ.4 No V病毒样颗粒疫苗研制中抗原含量检测。方法使用纯化的GⅡ.4 No V病毒样颗粒作为免疫原,分别免疫新西兰大白兔和豚鼠,制备抗血清。以豚鼠抗GⅡ.4病毒样颗粒多抗作为包被抗体,HRP标记的兔抗GⅡ.4病毒样颗粒多抗作为检测抗体,建立GⅡ.4 No V抗原ELISA定量检测方法,确定该方法的线性范围,并对该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性进行验证;用建立的方法检测GⅡ.4病毒样颗粒制备过程中间品的抗原含量。结果 GⅡ.4病毒样颗粒内部参考品在15.6~250 ng/ml范围内,线性关系良好,R20.98,高、中、低3个浓度样品回收率在90.9%~110.2%之间,板内和板间精密度试验的CV值均不超过15%;包被微孔板37℃放置6 d,稳定性试验的CV值均小于15%;与GⅡ.4No V病毒样颗粒之外的抗原均无交叉反应;可用于定量检测重组No V抗原制备过程中不同阶段样品。结论建立了GⅡ.4 No V抗原ELISA定量检测方法,该方法准确度、精密度、稳定性、特异性、适用性均良好,为No V病毒样颗粒疫苗的研制提供了质控方法。     

柯萨奇病毒A组16型实壳病毒颗粒与空壳病毒颗粒免疫原性的比较

目的比较柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)实壳病毒颗粒(full particle,FP)和空壳病毒颗粒(empty particle,EP)的免疫原性。方法以CVA16病毒株CVA16-L731感染Vero细胞,采用10层细胞工厂培养工艺培养病毒,收获液经离心纯化后,用甲醛灭活,获得灭活纯化的CVA16-L731 FP和EP。采用BCA法检测CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度,4%~12%SDS-PAGE、Western blot及透射电镜对CVA16-L731 FP和EP进行鉴定。以氢氧化铝为佐剂,分别以EP、FP、EP/FP为抗原,于第0、14、28天经后肢肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,于0、7、21、35、49、63、77、91 d对小鼠进行眼眶采血。采用微量中和试验法检测免疫小鼠血清中和抗体滴度,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,母传抗体保护试验检测CVA16-L731 FP和EP的垂直保护效果。结果纯化后的CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度分别达到420和150μg/ml;CVA16-L731 FP可见4条相对分子质量分别约为34 000(VP1)、26 000(VP2)、24 000(VP3)和8 000(VP4)的条带,CVA16-L731 EP可见3条相对分子质量分别约为36 000(VP0)、34 000(VP1)和24 000(VP3)的条带;CVA16-L731 FP和EP的纯度均可达95%;CVA16-L731 VP1兔多抗可与FP及EP的VP1、CVA16-L731 VP2兔多抗可与FP-VP2及EP-VP0发生特异性免疫反应;CVA16-L731FP和EP分别为内部不可被磷钨酸负染的FP致密圆形颗粒和内部可被磷钨酸负染的黑色EP圆型颗粒。小鼠免疫试验结果显示,第1次免疫后各抗原免疫组小鼠血清中和抗体阳性率均为100%;第2次免疫后血清中和抗体滴度和血清特异性Ig G水平均显著升高;第3次免疫后血清中和抗体滴度均无明显变化,但血清特异性Ig G水平均明显升高;第3次免疫后的63 d内,血清中和抗体滴度均无显著变化。各抗原免疫组乳鼠存活率均为100%。结论CVA16-L731 FP和EP均能诱导小鼠持续产生较高水平的血清中和抗体和特异性Ig G抗体,且母传抗体可保护2日龄乳鼠抵抗CVA16-S315的致死性攻击,为CVA16疫苗的研制提供了实验依据。     

生物反应器微载体系统培养Sabin株脊髓灰质炎病毒条件的优化

目的优化生物反应器微载体系统培养Sabin株脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)的条件,以提高Sabin株PV产量。方法应用搅拌式生物反应器培养PV,对其进行Vero细胞培养密度、病毒培养温度及病毒接种MOI条件的优化,收获病毒液后,检测病毒D抗原含量和感染性滴度,并进行全基因组深度测序。结果 9.0 g/L微载体培养Vero细胞得到病毒D抗原含量显著高于低微载体浓度培养结果(P0.01);病毒D抗原含量在34℃培养时最高(P0.01);病毒D抗原含量在MOI 0.050接种时最高(P0.05),MOI 0.010和MOI 0.005时无明显差异。SabinⅠ型480、525和Ⅲ型Pfizer株472、2 493位点突变率随着细胞培养密度(微载体浓度)的增加而增加;提高病毒培养温度以及改变病毒MOI,大多数毒力相关位点突变率无明显变化。结论提高细胞培养密度、以MOI 0.050接种病毒以及34℃培养病毒均有利于提高病毒产量。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

目的探讨诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在毕赤酵母表达系统中分泌表达的可行性。方法用pPICZa-A表达载体和X-33毕赤酵母株进行NoV GⅡ.4和GⅡ.17型VP1蛋白的分泌表达,并对阳性菌株进行Mut表型筛选。同时优化起始pH(5.0、6.0、7.0、8.0)、甲醇终浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)及发酵时间(24、48、72、96、120 h)3个表达条件。取原始及传代10代菌株,采用优化条件进行发酵,于诱导0～60 h间,通过双标准曲线实时荧光定量PCR法测定外源基因拷贝数。发酵产物经蔗糖密度梯度离心纯化后,检测其浓度及纯度,并观察VLP的形态。结果表达目的蛋白的重组酵母菌株均为Mut~+型。最佳发酵pH为7.0,甲醇终浓度为1%,发酵时间为72 h。菌株传代后未发生基因缺失,整合基因在10代内稳定性良好。GⅡ.4及GⅡ.17型VP1纯度均约85%,浓度分别为133和165μg/mL,VP1蛋白均可自发组装成直径约40 nm的VLP颗粒,形态与天然病毒相似。结论用毕赤酵母表达系统进行NoV VP1蛋白VLP分泌表达是可行的。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。     

猪卵透明带3α重组腺病毒的构建及纯化

目的构建猪卵透明带3α(pZP3α)重组腺病毒,并包装与纯化病毒,为研究猪ZP3α重组腺病毒避孕疫苗奠定基础。方法将pZP3α基因克隆至穿梭质粒pShuttle,重组穿梭质粒pSshuttle-pZP3α再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-5共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,脂质体法转染HEK293A细胞,包装并扩增病毒至第4代。收集重组病毒颗粒,经两轮氯化铯密度梯度离心纯化,紫外吸收法测定总病毒颗粒数(VP),并计算病毒的颗粒性滴度,空斑形成试验测定病毒的感染性滴度。以MOI为10的病毒剂量感染HeLa细胞,PCR鉴定插入病毒的目的基因,斑点免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达。结果pZP3α基因成功插入病毒基因组,pZP3α蛋白能在病毒感染的HeLa细胞中正常表达。病毒的颗粒性滴度约为1.3×1011VP/ml,感染性滴度约为3×109PFU/ml。结论已成功构建猪ZP3α重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,包装并纯化了重组pZP3α腺病毒颗粒。     

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ. 4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ. 4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ. 4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ. 4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15. 63～250 ng/mL,标准曲线R2均 0. 98;准确性验证的加标回收率在72. 23%～134. 03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7. 06%,中间精密性验证的RSD分别为8. 04%和9. 14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ. 4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。     

呈现人白细胞介素-13抗原表位的病毒样颗粒疫苗的构建

目的构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础。方法通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子与其受体结合部位潜在的B细胞表位;根据预测的人IL-13抗原肽,合成寡核苷酸序列,并经变性、退火形成双链DNA片段,插入表达乙肝核心抗原(HBcAg)的pThioHisA-HBcAg(NP)载体中,构建重组表达质粒,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)DH5α,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经硫酸铵沉淀、洗涤初步纯化,并经凝胶过滤层析、密度梯度离心、电镜观察检测其VLPs的存在;将纯化后的重组蛋白在不使用任何常规佐剂的情况下免疫昆明小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IL-13特异性抗体的滴度。结果预测分析获得了3个潜在的B细胞表位;3个重组表达质粒pThioHisA(NP)-A、B、C经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白HBcAg+A、B、C相对分子质量分别约为20 000、19 000、18 500,可被兔抗人IL-13多克隆抗体特异性识别,并以VLPs形式存在;HBcAg+A和HBcAg+B重组蛋白诱导小鼠产生了较强的抗体应答,血清中IL-13抗体滴度最高可达1∶64 000,而HBcAg+C重组蛋白未见特异抗体应答。结论成功构建了呈现人IL-13抗原表位的VLPs疫苗,该疫苗可有效打破B细胞免疫耐受,免疫小鼠后产生了高滴度的特异性抗体,为进一步在猴体哮喘模型和人类临床试验中开展IL-13疫苗主动免疫干预哮喘疾病进程的研究奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。