蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征

从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒(命名为SHY06),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52 h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征.根据F基因(1-374 bp)对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型结果表明SHY06属于基因Ⅶ型.F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因Ⅸ型NDV(F48E9等)同源性为91.7%～92.4%,与基因Ⅱ型(疫苗株LaSota等)同源性为89.2%. HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株(LaSota)和标准强毒株(F48E9)同源性较低,分别为87.6%和89.9%.     

新城疫病毒广东分离株F基因的克隆与序列分析

为研究新城疫病毒(NDV)基因变异情况,用RT-PCR扩增了9个广东分离株的F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-Teasy载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1 662 bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.1%~99.2%和96.0%~99.8%;但与LaSota、Roakin、F48E9及B1等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6%~92.2%。9个NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q/R-K-R-F-I-G119,与平均致死鸡胚时间(MDT)、脑内接种指数(ICPI)等病毒致病力测定结果相符,均属于基因Ⅶ型NDV。     

一株新城疫重组强毒的分离鉴定与分子特性分析

从患病蛋鸡中分离出1株新城疫病毒(NDV)SRZ/03,经蚀斑纯化后接种40日龄SPF鸡可诱发典型ND病变。蚀斑纯化前、后,MDT分别为55.2和51 h,ICPI为1.7和2.0,IVPI为1.91和2.79,表明属强毒。对其F和HN基因分别克隆测序,进行F基因分型。结果表明SRZ/03属基因Ⅱ型,F蛋白氨基酸裂解位点的序列为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒基序完全相同。结合GenBank中发表的其他NDV参考株序列,对F和HN基因推导氨基酸序列进行比较。SRZ/03株与基因Ⅱ型LaSota/46、B1/47、Bingham/87和Texas/48的同源性分别为93.1%、93.0%、94.4%和94.4%;与基因Ⅶ型Taiwan/95、SGM/01和SKY/03的同源性分别为92.2%、92.8%和92.8%;与基因Ⅲ型F48E9/48的同源性为91.2%。然而,SRZ/03株F蛋白前210个氨基酸与基因Ⅱ型LaSota/46和Texas/48的同源性较高,达96.7%和98.1%,后343个氨基酸则与Taiwan/95、SGM/01等毒株的同源性较高,达95.7%~97.4%,推测该株为重组株。此外,SRZ/03株与Taiwan/95、SGM/01等毒株的HN氨基酸同源性高达95.8%~97.6%,显著高于与LaSota/46、B1/47、Bingham/87、Texas/48和F48E9/48的87.2%~89.2%。     

1株越南斗鸡新城疫病毒的分离和分子鉴定

从一起新城疫暴发的病例中分离出1株新城疫病毒(NDV),命名为贵州分离株(DQ)。用RT-PCR方法扩增了贵州分离株的整个F基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1 662 bp,编码553个氨基酸。该毒株与国内2株分离株(CH2000、TW2000)之间的亲缘关系较近,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.7%~96.6%和96.6%~96.8%;但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的核苷酸和氨基酸同源性仅为84.0%~86.5%和87.2%~89.9%。DQ分离株在F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株特征相符,且具有101处的K(赖氨酸)和121处V(缬氨酸)2个特征性氨基酸,与NDV基因Ⅶ型的特性完全相符。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,该分离株为基因Ⅶd亚型。     

贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究

为了科学理解家鸭在新城疫病毒(NDV)流行和传播中的作用,对贵州不同地区分离的5株鸭源NDV强毒株进行遗传变异分析以及对鸭和SPF鸡的致病性研究。结果显示:5株NDV分离株均属于基因Ⅶd亚型,其F蛋白裂解位点基序均为112 RRQKRF117,符合强毒株序列特征,与病毒致病性指数测定结果相符;F和HN蛋白中功能性氨基酸位点均高度保守,但在HN蛋白线性表位区有3株发生E347K突变。交叉血凝抑制试验发现分离株与传统疫苗株LaSota的抗原同源性较低(为83.3%~87.0%),而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性较高(为93.5%~100%)。将5株NDV分离株以0.5mL病毒尿囊液原液通过肌肉注射感染鸭后未见明显发病死亡和病理变化,并且除脾外在其他多个组织脏器未能检测到病毒复制;而以106.0 ELD50·0.1mL-1剂量通过滴鼻点眼感染SPF鸡后6d内100%发病死亡,病死鸡表现出新城疫典型的临床症状和病理变化,病毒在多个组织脏器中均能复制且对脾、胸腺和法氏囊等免疫器官损伤严重。另外,SPF鸡攻毒后喉头和泄殖腔棉拭病毒分离率明显高于试验鸭。本研究结果表明,贵州省鸭群中流行的基因Ⅶd亚型NDV强毒株HN蛋白发生E347K突变的变异株呈上升趋势,并与传统疫苗株产生抗原差异;5株鸭源NDV强毒株对鸭和鸡致病性差异显著,虽然对鸭无明显致病性,但鸭感染后可在较长时间内通过喉头或泄殖腔向体外排毒,因此必须采取有效措施防止NDV强毒由鸭群向鸡群的传播。     

某规模场产蛋量下降鸡群新城疫病毒分离与鉴定

对某规模场鸡群采集的23份鸡咽喉或泄殖腔棉拭子进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测,证实分离出17株新城疫病毒(NDV)。对F、HN基因经RT-PCR扩增、克隆并对其进行测序,选取具有代表性的4个毒株进行序列比对及遗传演化分析。系统发育分析结果表明,4株病毒均属于基因Ⅶe型,F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具备NDV强毒株裂解位点氨基酸排列特征。其F基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于96.1%~96.7%、97.3%~98.0%;与P1株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于95.0%~95.4%、96.2%~96.7%,其HN基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于96.2%~96.5%、95.3%~95.9%;与SN-5-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于94.9%~95.3%、96.4%~96.8%。血清学交叉试验显示,NDV分离毒株为抗原测得的同批血清样品抗体效价存在显著差异。近年流行的新城疫疫情主要由基因Ⅶ型NDV引起的,该规模场产蛋量下降可能与F和HN基因的变异有关。     

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定及F与HN基因序列分析

从广东珠三角地区某鸽场的发病鸽群采样,接种10日龄SPF鸡胚后分离到一株病毒,命名为JP株。系列微量血凝和微量血凝抑制试验结果表明,新城疫病毒(NDV)阳性。测序结果显示,该NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特点;F基因分型表明,JP株属于基因Ⅵ型。Blast结果显示,JP株F、HN基因序列均与基因Ⅵ型pi/CH/LGD/110208株同源性最高,均达99%。同源性比较发现,F和HN基因、蛋白都与基因Ⅵ型新城疫毒株同源性较高,分别为92.5%~99%、95.5%~99.1%和90.6%~98.7%、91.9%~99%,而与国内常用疫苗株B1、La Sota、Mukteswar等同源性较低,分别为83.2%~85.9%、89.2%~91%和79.3%~83.4%、86%~89.5%。分离的JP株属于基因Ⅵ型,并与国内常用疫苗株存在一定的差异。     

10株广西野鸟源新城疫病毒HN基因的遗传进化分析

对分离自广西4种鸟类的10株新城疫病毒(NDV)分离株,进行HN基因的RT-PCR扩增、序列测定和分析,旨在探讨广西野鸟源NDV HN基因的分子进化特征,为科学防控新城疫提供依据。结果显示,10株广西野鸟源NDV分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp,编码571个氨基酸,符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示,2株鹧鸪源NDV分离株与NDV基因XII型同源性高达98.0%～98.1%, 5株斑鸠源和3株鸽子源NDV病毒与NDV基因VI型的同源性高达90.0%～91.9%。遗传进化分析显示,10株广西野鸟NDV分离株与我国经典强毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我国目前应用最广的疫苗株基因型)遗传距离较远。     

辽宁省新城疫病毒F基因和HN基因的分子特征与致病性

采用RT-PCR对新城疫病毒辽宁分离株的F基因和HN基因进行扩增并测序,初步研究其分子特性分析和致病性。结果表明,分离株CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的致死鸡胚平均时间(MDT)分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h,CY1株具有强毒特征。F基因分型显示,CY1株属于Ⅶ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序特征,与流行株js02株的亲缘关系非常近,与疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。DD2株、YK1株和TL4株均属于基因Ⅱ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112GRQGRL117,符合NDV非强毒氨基酸基序特征,与LaSota株亲缘关系最近。本研究将为本省新城疫防制对策的制定提供参考。     

从种蛋中分离的新城疫病毒抗原性及其F和HN基因的分析

对3株首次从种蛋中分离到的NDV进行交叉HI试验表明,这3株分离毒的交叉HI同源性为98.1%～100%。对这3株病毒及另1株从输卵管分离到的NDV的F与HN完整基因进行扩增并克隆测序,序列结果登陆GenBank(FJ011441～FJ011448)。氨基酸同源性分析表明:这4个毒株的F与HN基因同源性分别为99.5%～99.8%和99.6%～100%,远高于其与Lasota、F48E8株以及目前国内流行的其他基因Ⅶ型毒株的同源性。分离株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特征,根据绘制的遗传进化树分析,属于基因Ⅶ型。研究结果显示这4个不同来源毒株其2个基因的同步高度同源性可能与它们均是与生殖道感染有关。     

2008年江苏地区基因Ⅶd亚型新城疫病毒遗传变异分析

为了研究基因Ⅶ d亚型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的分子流行病学及遗传变异规律,作者对2008年分离自江苏地区16株具有一定代表性NDV分离株的F和HN基因片段进行了扩增.根据F基因和HN基因序列绘制的2个遗传进化树基本一致,表明分离株中不存在囊膜糖蛋白基因发生重组的NDV;同时,HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势.基因Ⅶd亚型变异株的出现应引起相关领域从业者们的高度重视.     

2006～2008年华东地区新城疫病毒HN基因序列分析

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的HN（血凝素-神经氨酸酶,hemagglutinin—neuraminidase）基因分子流行病学规律,利用RT—PCR扩增了2006～2008年间分离自我国华东地区的43株NDV的HN基因片段。基因序列分析显示,分离株中基因Ⅰ型2株,基因Ⅱ型3株,基因Ⅵ型1株,其它37株都属于基因Ⅶd亚型。根据遗传发生进化树可将基因Ⅶd亚型进一步分为Ⅶd1和Ⅶd2两个亚型,基因Ⅶd1亚型HN蛋白的第102、118、443位氨基酸分别为T,A和T,而基因Ⅶd2亚型则分别为I,E和M。另外,研究表明HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势。     

几株鸡新城疫病毒的分离鉴定及其基因型分析

从几个发生禽病的地区分离到6株病毒,经过血凝试验、血凝抑制试验、中和试验、分子生物学试验等确定为鸡新城疫病毒;根据GenBank公布的新城疫F基因强弱毒株相关基因序列设计合成1对特异性引物,扩增出的F基因片段长度约为610 bp,测序后进行序列比对,并分析其核苷酸序列和氨基酸序列,结果显示,有3株具有新城疫强毒株特性,同时还具备新城疫Ⅶ基因型特征,另外根据平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉致病指数(IVPI)指标测定结果,最终判定这3株是新城疫强毒株且属于基因Ⅶ型,其余3株病毒分离株与La Sota的核酸序列同源性与氨基酸序列同源性均为99%。     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源.结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析.结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时I、II、V和IX多种基因型并存.同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论.     

2008-2009年部分地区新城疫病毒分离株的进化分析

本研究旨在从分子水平上掌握中国新城疫病毒的变异情况和新城疫的流行规律,对2008-2009年从中国部分省市养殖场分离的9株新城疫病毒毒株,采用RT-PCR方法扩增其F和HN基因,经克隆和测序,对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,9株分离株有8株为基因Ⅶ型,1株为基因Ⅱ型,F基因开放性阅读框架(ORF)为1662 bp,强毒株同La Sota的核苷酸同源性为83.5%~84.2%。HN基因开放性阅读框架(ORF)为1716或1734 bp,强毒株在538位缺失1个糖基化位点。结果表明,近年流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型NDV引起,F和HN基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

1株广东鸡源新城疫病毒的分离鉴定和毒力基因分析

从广东粤东地区某商品蛋鸡场的发病鸡群中分离到1株病毒（YS株）,经血凝和血凝抑制试验确定为新城疫病毒（NDV）.对该分离株的F蛋白氨基酸序列的分析结果表明,其F0裂解位点的氨基酸序列为1nR-R-Q-K-R-F117,且含有101K和121V,符合典型NDV强毒株的分子特点.遗传分析结果显示分离株属于基因Ⅶd亚型.F和HN基因的氨基酸相似性分析表明,分离株与基因Ⅶ型NDV Chicken/China/Shandong/02/2010株的相似性最高,均达到99％,而与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和La Sota的相似性则较低,分别在86.8％～ 90.4％和87.2％～88.3％之间,说明分离株与经典的NDV毒株存在一定的差异.     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。