二化螟Cry1Ac汰选品系对不同Bt蛋白的敏感性

为明确靶标害虫对Bt蛋白的抗性及对不同类型Bt蛋白的交互抗性,采用生物测定法进行了二化螟Chilo suppressalis(Walker)敏感品系和Cry1Ac汰选品系在Cry1Ac毒饲料上的时间-死亡率反应、对不同Bt杀虫蛋白的敏感性及不同Bt蛋白复配组合对二化螟毒力效果的研究。结果表明,二化螟Cry1Ac汰选品系已对36.67μg/mL(LC_(50))的Cry1Ac杀虫蛋白产生了一定的适应性,但对308.69μg/mL(LC90)的Cry1Ac蛋白反应仍较敏感。Cry1Ac敏感品系和汰选品系对Cry1Ab蛋白的LC_(50)分别为1.40μg/mL和3.86μg/mL,二者差异显著,但对Cry1Ca(1.63μg/mL和1.73μg/mL)或Cry2Aa(127.48μg/mL和144.50μg/mL)的LC_(50)差异不显著,即Cry1Ac汰选品系与Cry1Ab存在明显的交互抗性,但与Cry1Ca和Cry2Aa不存在交互抗性。在不同Bt蛋白复配组合中(1∶1复配),Cry1Ab+Cry1Ca、Cry1Ab+Cry2Aa和Cry1Ca+Cry2Aa增效作用最为显著。表明抗虫基因cry1Ca和cry2Aa可作为双价转基因抗虫水稻研发的候选基因。     

Cry1Ac杀虫蛋白对甜菜夜蛾飞行能力的影响

转Bt基因作物上害虫取食Bt杀虫蛋白后存活并羽化的成虫飞行能力对于其飞离Bt作物,寻找庇护所中敏感个体进行交配、产卵,从而稀释抗性基因频率,实现“高剂量/庇护所”抗性治理策略具有重要意义。本文对取食含不同浓度Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的初羽化（未取食补充营养）甜菜夜蛾飞行能力进行了测试,结果表明,幼虫取食含25、50、100 μg/g和200 μg/g Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料存活并羽化的成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均差异显著（p<0.05）。取食含较低浓度Cry1Ac杀虫蛋白（25 μg/g和50 μg/g）的人工饲料有促进成虫飞行的倾向,尽管与取食不含Cry1Ac杀虫蛋白的对照相比,成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均未达到显著增加的水平,但强飞行个体比例明显增加。随着饲料中Cry1Ac杀虫蛋白浓度的升高,羽化的成虫飞行能力显著下降。雄蛾飞行能力下降的程度比雌蛾更加明显。这些数据为转Bt基因作物上迁飞性害虫的种群动态规律及其潜在的抗性治理策略提供了科学依据。     

两种不同化学农药抗性背景小菜蛾对BtCry1Ac蛋白敏感度的比较

为在小菜蛾防治中合理使用化学杀虫剂和生物农药Bt,探究了小菜蛾对化学农药的抗药性与其对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的敏感度之间的关系。采用浸叶法测定了2个抗性背景不同的小菜蛾种群对9种常用杀虫剂和Cry1Ac蛋白的敏感度,通过比较敏感度差异,初步探索了小菜蛾对化学农药的抗药性和其对Cry1Ac蛋白敏感度之间的关系。结果表明:采自广东博罗县田间的小菜蛾种群(GDBL)对除Cry1Ac之外的9种常用杀虫剂,均已产生了不同程度的抗药性;而北京室内小菜蛾种群(BJNK),虽然对高效氯氰菊酯、阿维菌素、茚虫威、多杀菌素、溴虫腈具有抗性,对Cry1Ac在内的其他5种杀虫剂仍比较敏感。可见,对多种不同类型的杀虫剂产生了不同程度抗性的两个小菜蛾种群,对Cry1Ac蛋白仍处于敏感状态。由于小菜蛾对化学杀虫剂的抗性机制与其对Cry1Ac的抗性机制不同,小菜蛾对化学杀虫剂的抗药性与其对Cry1Ac的抗药性之间不存在交互抗性。因此,在田间可以通过加强Bt杀虫剂的使用来提高对多种化学杀虫剂产生抗性的小菜蛾的防治效果。     

荧光增白剂对Cry1Ac抗感棉铃虫围食膜的影响及增效作用

为了提高Bt的杀虫活性,运用扫描电镜、SDS-PAGE电泳和生物测定技术,研究了荧光增白剂FB28对棉铃虫Cry1Ac抗性和敏感品系围食膜的影响及对Cry1Ac杀虫蛋白的增效作用。结果表明,正常棉铃虫围食膜表面光滑致密,没有空洞和缝隙。用含1%FB28的人工饲料饲喂刚蜕皮的5龄棉铃虫幼虫2 h后,抗感棉铃虫围食膜表面均出现许多空洞,且敏感棉铃虫的空洞明显大于抗性棉铃虫;随着处理时间的延长,围食膜上的空洞逐渐变小,13 h后恢复正常。用1%FB28离体或活体处理抗、感品系棉铃虫,均可造成围食膜蛋白被降解。用1%FB28与Cry1Ac杀虫蛋白混合饲喂抗、感棉铃虫初孵幼虫,可明显提高棉铃虫的死亡率,且对抗性品系的增效作用明显大于敏感品系,对敏感和抗性品系棉铃虫的增效比分别为2.23和9.34;1%FB28还可以明显增加对抗、感品系3龄棉铃虫幼虫的生长抑制作用。     

蛋白质转导结构域增加Cry1Ac对小菜蛾的毒力研究

蛋白质转导结构域是一类能自动穿透细胞膜,并能作为载体将其他生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。本研究通过遗传重组的方法,构建蛋白质转导结构域TAT与Bt杀虫蛋白Cry1Ac的融合基因及其表达载体TAT-Cry1Ac,对表达蛋白的生测结果表明,TAT极为显著地增加Cry1Ac对小菜蛾的杀虫毒力,增效倍数达到5.54倍,预示着TAT在微生物杀虫蛋白领域可能有着良好的应用前景。     

转Bt基因玉米(瑞丰125、DBN9936、DBN9978)对亚洲玉米螟的抗虫效果研究

评价转Bt基因玉米对靶标生物亚洲玉米螟的杀虫作用是转基因玉米研发的重要一环。本文采用室内生测法对3种转Bt基因抗虫玉米‘瑞丰125’(表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白),‘DBN9936’‘DBN9978’(表达Cry1Ab杀虫蛋白)对亚洲玉米螟敏感品系ACB-S及抗Cry1Ab品系ACB-AbR、抗Cry1Ac品系ACB-AcR、抗Cry1F品系ACB-FR、抗Cry1Ah品系ACB-AhR、抗Cry1Ie品系ACB-IeR的杀虫活性进行测定,同时采用心叶期和抽丝期人工接虫法进行田间抗虫效果鉴定。结果表明,取食3种Bt玉米的ACB-S幼虫, 3 d死亡率100%,而取食对照常规玉米3 d存活率100%。取食3种Bt玉米的5个抗性品系幼虫除ACB-AbR和ACB-AcR有2%~6%的个体存活4~5 d, 6 d死亡率也达到了100%,其余品系均在3 d全部死亡,而取食对照玉米5~6 d的死亡率仅为4%~14%,差异显著。田间心叶期食叶级别及穗期活虫数、雌穗被害和茎秆被蛀等为害等级说明3种Bt玉米高抗亚洲玉米螟。明确了‘瑞丰125’‘DBN9936’和‘DBN9978’对亚洲玉米螟有很高的杀虫活性和田间防治效果。5个Bt蛋白抗性亚洲玉米螟品系幼虫在常规玉米上显示一定的适合度劣势。     

Cry1Ac抗性亚洲玉米螟对四种Bt蛋白的交互抗性

种Bt蛋白Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ah和Cry1Ie对敏感品系ACB-BtS和抗性品系ACB-AcR的毒力,结果显示,ACB-AcR对Cry1Ah的相对抗性倍数达14.9倍,有显著的交互抗性;对Cry1Ab的相对抗性倍数为4.3倍,交互抗性水平较低;对Cry1Ie的相对抗性倍数为0.9,即无交互抗性.4种蛋白对抗、感品系的EC50表明,ACB-AcR品系对Cry1Ac蛋白产生了显著的抗性,相对抗性达到32.6倍,对Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性,而对Cry1Ie没有交互抗性.     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

入侵云南草地贪夜蛾种群对5种常用Bt蛋白的敏感性评价

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是原分布于美洲大陆热带和亚热带地区的一种重要玉米害虫。在当地,种植抗虫转基因玉米是防控草地贪夜蛾危害的主要手段。该虫于2019年1月入侵我国云南省,为明确入侵我国云南的草地贪夜蛾种群对常用Bt蛋白的敏感性水平,本文通过饲料表面涂抹法测定了瑞丽草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab以及Vip3A等5种Bt蛋白的敏感性。结果表明:几种常用Bt蛋白对瑞丽草地贪夜蛾致死作用顺序为Vip3ACry1AbCry1FCry2AbCry1Ac,对草地贪夜蛾抑制生长发育的顺序为Cry1AbCry1FVip3ACry1AcCry2Ab。此外,与美国相对敏感种群比较,云南瑞丽草地贪夜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A的敏感性指标在0.28～3.76之间,表明该入侵种群对此5种Bt蛋白均未产生抗性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米作为防控草地贪夜蛾的技术体系提供依据。     

V-ATPase H表达量下调增强棉铃虫对Cry1Ac的抗性

棉铃虫Helicoverpa armigera是世界性重要农业害虫。目前防治棉铃虫的主要手段是种植转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白的转基因作物。本文旨在研究棉铃虫V-ATPase H在Cry1Ac蛋白毒力和抗性中的作用。利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析V-ATPase H在Cry1Ac抗、感品系棉铃虫幼虫中肠及敏感品系棉铃虫幼虫受Cry1Ac诱导后的表达情况;在昆虫Sf9细胞中过表达V-ATPase H对其进行细胞定位,通过细胞毒力试验验证其对Cry1Ac毒力的影响。结果发现棉铃虫V-ATPase H基因在抗性品系中低表达,并且V-ATPase H在受到Cry1Ac诱导时也低表达;在Sf9细胞内表达V-ATPase H蛋白发现其在整个细胞中都有分布,过表达该蛋白后增强了细胞对Cry1Ac蛋白的敏感性。结果表明V-ATPase H参与Cry1Ac蛋白的毒力。     

Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对大草蛉生长发育及酶活力的影响

为明确转Cry1Ac和Cry2Ab基因棉花对大草蛉的影响,运用Bt蛋白与人工饲料混合的方法,以大于转基因棉花叶片中蛋白含量20倍的剂量饲喂大草蛉初孵幼虫,初步研究了Cry1Ac和Cry2Ab对大草蛉生物学参数和消化酶、解毒酶活性的影响。结果表明：取食含Bt蛋白饲料的大草蛉幼虫的发育历期、体重、蛹重、成虫体重、羽化率等生物学参数与对照相比均没有显著差异;在大草蛉幼虫体内可以检测到含量较高的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白,分别为974.92~1 282.39 ng/g鲜重和5 592.62~6 082.92 ng/g鲜重,而在大草蛉成虫体内检测到的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白含量非常低,分别为0.29~0.39 ng/g鲜重和50.34~56.71 ng/g鲜重;取食含Bt蛋白的饲料对大草蛉幼虫的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性有一定的影响,但对大草蛉成虫影响与对照差异不显著。表明大草蛉取食含Bt蛋白的人工饲料后,虽然体内可以检测到一定含量的Bt蛋白,但对大草蛉的生长发育并没有显著的直接不利影响。     

抗Bt杀虫蛋白棉铃虫种群的相对适合度

在室内条件下,比较了对苏云金杆菌（Bacillus thuringinesis,Bt)杀虫蛋白（ICP）有20倍抗性的棉铃虫（Helicoverpa armigera Huebner)种群（R种群）与同源对照种群（S种群）之间的相对适合度,结果表明,与S种群相比,R种群的产卵量,卵孵化率和化蛹率明显降低,幼虫历期和蛹历期明显延长,R种群相对于S种群的适合度为0．65。杂交F1代RS种群相对于S种群的适合度为1．6,显示出杂交优势,正反交F1代种群对Bt ICP敏感性的差异不显,表明棉铃虫对Bt ICP的抗性遗传不存在性连锁,为常染色体遗传。     

小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展的研究

使用苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种（Btk）可湿性粉剂对小菜蛾进行继代汰选获得F₈₀代和F₁₀₀代抗性品系。通过分别测定Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca四种杀虫晶体蛋白对小菜蛾Btk抗性品系F₈₀代和F₁₀₀代的室内毒力,明确了小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展规律。研究结果表明,汰选至F₈₀代时,Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀约12.1 mg/L,其次为Cry1Ac,LC₅₀约47.7 mg/L;而汰选至F₁₀₀代时,仍以Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀约21.4 mg/L,其次为Cry1Ab,LC₅₀约72.2 mg/L。与相对敏感品系相比,小菜蛾抗性品系对Cry1Ac的抗性发展较快（抗性倍数高达67.3～106.8倍）,对Cry1Ab的次之（抗性倍数高达60.0～66.1倍）,而对Cry1Ca和Cry1Ah的抗性发展较慢（抗性倍数分别为3.4～6.0倍和1.6～2.5倍）。以上结果说明,在主效杀虫基因为Cry1Ac的Btk药剂选择压力下,小菜蛾对四种Bt杀虫晶体蛋白的抗性发展速度差异较大,且Cry1Ac和Cry1Ab存在交互抗性风险。     

Binding of three Cry1A toxins in resistant and susceptible strains of cotton bollworm (Helicoverpa armigera)

Evolution of resistance by pests is the greatest threat to the continuous success of theBacillus thuringiensis (Bt) toxins used in conventional sprays or in transgenic plants. The most common mechanism of insect resistance to Bt is reduced binding of toxins to target sites in the brush border membrane of the larval mid-gut. In this paper, binding experiments were performed with three ¹²⁵I-Cry1A toxins and the brush border membrane vesicles from Cry1Ac resistant or susceptible strains of Helicoverpa armigera. The homologous competition test showed that there was no significant difference in Cry1Ac-binding affinity, but the concentration of Cry1Ac-binding sites dramatically decreased in the resistant strain (R_t decreased from 5.87 ± 1.40 to 2.23 ± 0.80). The heterologous competition test showed that there were three Cry1Ac-binding sites in the susceptible strain. Among them, site 1 bound with all three Cry1A toxins, site 2 bound with both Cry1Ab and Cry1Ac, and site 3 only bound with Cry1Ac. In the Cry1Ac resistant strain, the binding capability of site 1 with Cry1Ab decreased and site 2 did not bind with Cry1Ac. It is suggested that the absence of one binding site is responsible for H. armigera resistance to Cry1Ac. This result also showed that the resistance fitted the “mode 1” pattern of Bt resistance described previously.     

Cross-resistance between a Bacillus thuringiensis Cry toxin and non-Bt insecticides in the diamondback moth

BACKGROUND: Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) crystal (Cry) toxins are expressed in various transgenic crops and are also used as sprays in integrated pest management and organic agricultural systems. The diamondback moth (Plutella xylostella L.) is a major worldwide pest of crucifer crops and one that has readily acquired field resistance to a broad range of insecticides.RESULTS: Selection of a subpopulation of the P. xylostella SERD4 population with the pyrethroid deltamethrin increased resistance to both deltamethrin and Cry1Ac relative to an unselected subpopulation. Selection of a second subpopulation with the Bt toxin Cry1Ac also increased resistance to both Cry1Ac and deltamethrin. A complementation test between the Cry1Ac-selected and deltamethrin-selected subpopulations suggested the presence of a common genetic locus or loci that control resistance to both insecticides. A piperonyl butoxide analogue with potent inhibitory activity against insect esterases significantly increased the toxicity of Cry1Ac and deltamethrin against the respective resistant subpopulations, but showed no such synergism with the unselected subpopulation of SERD4.CONCLUSION: Selection of one resistance phenotype resulted in the simultaneous selection of the other. This phenomenon could be due to a single mechanism acting against both classes of insecticide or to genetically linked, but separate, mechanisms.     

中黑盲蝽对四季豆豆荚和棉铃虫卵的取食选择性

盲蝽类害虫具有杂食性特点,但已有的取食行为研究主要集中于植食性,缺乏对其食性的全面认识。本文观察了中黑盲蝽在有选择和无选择条件下对四季豆豆荚和棉铃虫卵的取食与选择行为,并利用刺探电位技术分析了其对四季豆豆荚和棉铃虫卵的刺吸行为。研究显示:3种处理上中黑盲蝽总取食时间比例分别为:混合食物(四季豆豆荚和棉铃虫卵)38%、四季豆豆荚33%、棉铃虫卵27%,混合食物上取食四季豆豆荚的时间比例(22%)高于棉铃虫卵(16%)。6h测试时间内,中黑盲蝽刺吸四季豆豆荚时间为6 595s,高于棉铃虫卵(3 641s);单次刺吸时间以在四季豆豆荚上较高(334s)。以上结果表明中黑盲蝽喜欢取食混合食物,且倾向取食刺吸植物。研究结果对进一步解析中黑盲蝽的杂食性,探明其在生态系统中的地位及开发人工饲料有重要科学意义。     

抗Bt棉铃虫种群的交互抗性研究

分别用对CyrlAc抗性达11．6倍的Bt棉叶和Bt粉剂（Btk)汰选棉铃虫（Heliocoverpa armigera)种群（对Btk的抗性指数为5．2倍）,测定了其对不同Bt制剂,Bt毒素,化学农药的交互抗性,结果表明：停止汰选后,Bt棉叶汰选种群对CrylAc的抗性指数为5．9倍,对CrylAc 1C的交互抗性为3．7倍,对Btk的敏感性降低,对Bta,Cry2A无交互抗性,Btk汰选种群对Btk的抗性指数为4．1倍,对Bta,CrylAc,CrylAc 1C的交互抗性为2．3,3．1,2．3倍,对Cry2A无交互抗性,两汰选种群对化学农药灭多威,辛硫磷,氯氰菊酯的敏感性均有所增加。