肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的PCR复合检测

肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒是常见的2种DNA对虾病毒,在虾类养殖业中经常会出现混合感染。因此,建立这2种病毒的复合检测方法显得尤为重要。根据基因库中肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的保守序列,设计了肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的特异性引物,对这2种病毒PCR复合检测的反应条件和试剂浓度进行优化,退火温度55℃,主要试剂Mg2+终浓度为3mmol/L,dNTP终浓度为0.4 mmol/L,引物终浓度为0.8μmol/L。进一步比较了在优化后的PCR反应体系下,检测单种病毒和同时检测这2种病毒的灵敏度差异。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大.本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(8.83×103病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应.本方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况,为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段.     

以中药为主体 综合治理对虾病毒病

通过几年的试验观察,治理病毒性虾病,我们认为应该采用对虾体无刺激,对水体无污染,长期应用亦无残毒和任何副作用的中药进行综合治理,巧妙地协同对虾在与大自然作斗争中尽快地完成这次再适应过程,这才是防止对虾病毒病应遵循的本质。 对虾本来是个生长繁殖快,生存适应能力强的大群体,依靠很简单的消化器官进行营养的吸收与代谢,而肝胰腺是功能的中心,中肠从肝胰腺的中间通过,当肝胰腺的功能反常时肝胰细胞就充血肿大萎缩变性,必然引起中肠通道的狭窄,发生消化障碍,先是假性饱胃率的增多,继而停食而致死。根据流行病学的调查:在我国沿海肝胰腺类细小病毒(HPV)、中肠腺坏死杆状病毒(BMN)、传染性皮下造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)等病毒性虾病均有发生,而这些病毒所侵害的器官又都以肝胰腺的病变为主。在发病的高峰期在近海与进水口所捕捞的自然界生长对虾进行观察,经常发现肝胰腺都有轻重不同的病变,但尚能生存且较池中为好,看来海域中所捕捞的亲虾,以及浮游生物中都有携带病毒的隐患,只是需要一定条件下才可能造成强毒力株的增殖而发病。     

对虾育苗期的常见病害及防治

虾病大体上分为由生物引起的疾病和非生物性疾病两大类。目前我国已查明的对虾养殖疾病有40多种,其中育苗期疾病近20种。虾病对育苗工作带来严重威胁,直接影响虾苗的产量。 1.病毒病 对虾育苗期发现的常见病毒有:对虾肝胰腺细小病毒(HPV),斑节对虾杆状病毒(MBV)和日本对虾中肠     

PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)

利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng／μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNV DNA的检出灵敏度为24．8pg,可检出26．6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250．4ng健康虾组织DNA、202．5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病学调查,并具有较高的应用价值。     

对虾肝胰腺细小病毒滚环扩增检测方法的建立

根据对虾肝胰腺细小病毒(HPV)保守基因序列,设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化反应条件,建立了肝胰腺细小病毒超分支滚环扩增检测方法。实验中采用一步法连接,探针在Taq DNA连接酶作用下,58℃连接40 min、62℃扩增30 min便可以扩增出明显条带。反应特异性验证实验表明,该体系能够特异性地检测出HPV,而不与供试的其他对虾病原发生交叉反应;灵敏度分析结果显示该方法的检测极限为105 copies/μl,与PCR检测方法相比,一步法连接的滚环扩增的灵敏度低两个数量级。该方法反应过程中温度变化次数少,基本都在等温条件下进行,不需要PCR仪,可发展成为在简便实验条件下使用的简易检测方法。     

淡水螯虾的病毒性病原研究进展

综述了国内外对淡水螯虾病毒性病原的研究情况,内容包括对虾白斑绦合征病毒,杆形病毒(欧洲螯虾杆形病毒、白螯螯虾杆形病毒、宽大太平螯虾杆形病毒、雅比螯虾杆形病毒、红螫螯虾杆形病毒),细小病毒(包括雅比螯虾系统性细小病毒、红螯螯虾鳃细小病毒、红螯螯虾细小病毒、红螯螯虾产卵死亡综合征细小病毒),红螯螫虾肝胰腺呼肠孤病毒,传染性肌肉坏死病毒,小RNA病毒等.     

肝胰腺细小病毒(HPV)PCR检测及流行情况调查

采用水产行业标准《对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第1部分:PCR检测法》(SC/T7203.1-2007)的方法,对2011-2013年期间我国沿海7个省市主要养殖对虾品种不同生长阶段的对虾样品进行该病毒携带情况的筛查。该方法的检测灵敏度为0.07 fg,相当于大约20个病毒拷贝。结果显示,639份样品的HPV阳性检出率为18.47%。其中,在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)中均有阳性检出,且仔虾、幼虾、成虾各个阶段均可检出HPV,表明HPV已在我国养殖对虾中存在并流行。本研究结果为对虾养殖生产提供了疫病的科学数据,为我国养殖对虾中该病的流行情况提供了参考依据。     

肝胰腺细小病毒(HPV) PCR检测及流行情况调查

采用水产行业标准《对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第1部分:PCR检测法》(SC/T7203.1-2007)的方法,对2011-2013年期间我国沿海7个省市主要养殖对虾品种不同生长阶段的对虾样品进行该病毒携带情况的筛查。该方法的检测灵敏度为0.07 fg,相当于大约20个病毒拷贝。结果显示,639份样品的HPV阳性检出率为18.47%。其中,在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)中均有阳性检出,且仔虾、幼虾、成虾各个阶段均可检出HPV,表明HPV已在我国养殖对虾中存在并流行。本研究结果为对虾养殖生产提供了疫病的科学数据,为我国养殖对虾中该病的流行情况提供了参考依据。     

几种养成虾的病毒携带状况检测

用组织病理学方法检测了深圳市及其临近地区养殖对虾携带病毒的情况。检查１１８尾外观正常的养殖对虾，包括斑节对虾，长毛对虾，近缘新对虾和刀额新对虾。检出带有斑节对虾杆状病毒包涵体的个体２０尾，约占１７％；带有对虾肝胰腺类细小病毒包涵体的个体４尾，约占３．３％。     

Development of a multiplex PCR system for the simultaneous detection of white spot syndrome virus and hepatopancreatic parvovirus infection

A multiplex PCR kit for simultaneous detection of white spot syndrome virus (WSSV) and hepatopancreatic parvovirus (HPV) was developed and field testing was conducted. A 604‐bp target sequence was selected from the vp28 gene of WSSV. A primer set was developed to amplify a 338‐bp DNA fragment at the junction of the NS2 and NS1 protein genes of HPV after alignment of eight sequences from different strains. Another internal positive control primer set produced a 139‐bp PCR fragment from the β‐actin gene by alignment of this gene from Litopenaeus vannamei, Fenneropenaeus chinensis and Penaeus monodon. The detection limits, tested using purified plasmids, for WSSV and HPV were 21.4 and 19.0 copies respectively. The optimum ratio for HPV, WSSV and β‐actin was 3:1:1, with an optimum annealing temperature of 57°C. Field test of the multiplex PCR with 170 L. vannamei individuals from 17 aquaculture farms showed 41.8% coinfection with WSSV and HPV, and 40.0% and 3.5% single infection with WSSV and HPV respectively. No virus‐free shrimp farm was found. Ten wild catch F. chinensis individuals showed 60% coinfection, and 40% were infected with HPV.     

罗非鱼罗湖病毒ORF10蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

为了研究罗非鱼罗湖病毒(tilapia lake virus, TiLV) ORF10 蛋白的功能, 从染病莫桑比克罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏和肝脏组织中克隆获得 TiLV ORF10 基因编码序列, 并成功构建了荧光定位载体 pEGFP-ORF10 和重组表达载体 pET32a-ORF10。将荧光定位载体 pEGFP-ORF10 转染鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC), 经荧光显微镜观察, 在 EPC 的细胞核中观察到绿色荧光信号, 表明该蛋白定位于细胞核中。将重组载体 pET32a-ORF10 转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行目的融合蛋白表达, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明, His-TiLV ORF10 融合蛋白成功表达并主要存在于上清液中。随后, 采用 Ni-NTA 亲和层析的方法纯化融合蛋白 His-TiLV ORF10, 以其为抗原多次免疫 Balb/C 小鼠, 制备多克隆抗体。蛋白印迹法(WB)分析显示, 制备的抗体可以特异性识别 His-TiLV ORF10。利用蛋白印迹法进一步对感染 TiLV 莫桑比克罗非鱼的不同来源组织进行检测, 结果显示, TiLV ORF10 蛋白在染病莫桑比克罗非鱼肌肉、脾脏、肝脏和肾脏中的表达存在较大差异, 其中以肝脏和肾脏组织表达量为最高, 脾脏次之, 肌肉中表达量最低。本研究为深入了解 TiLV ORF10 蛋白的功能和病毒侵染与致病等机理提供了重要基础。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66基因DNA疫苗载体的构建及其免疫效果

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)能够引起鲫大量死亡,严重威胁我国水产养殖业的健康发展,目前,针对CyHV-2尚无有效的商业化疫苗或治疗措施。为构建CyHV-2DNA疫苗,本研究将其衣壳蛋白ORF66编码基因克隆至pVAX1真核表达载体上,构建重组质粒pVAX-ORF66。此外,在BL21(DE3)pLysS中对ORF66蛋白进行了原核表达,表达蛋白经纯化后免疫新西兰白兔制备了ORF66特异性抗体。酶联免疫吸附(ELISA)检测显示,制备抗体效价达1∶20000以上。将pVAX-ORF66质粒转染金鱼脑细胞系(GFB),利用制备的ORF66抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测,结果显示,ORF66蛋白可以在细胞中大量表达,且主要定位于细胞质中。将pVAX-ORF66质粒肌肉注射鲫后进行CyHV-2免疫保护实验,结果表明,其相对免疫保护率达55.6%。本研究针对CyHV-2构建了一种制备简单、成本低廉的DNA疫苗,为鲫造血器官坏死病的免疫预防及感染分子机制研究奠定了前期实验基础。     

A new strain of white spot syndrome virus affecting Litopenaeus vannamei in Indian shrimp farms

White spot syndrome virus (WSSV)‐infected shrimp samples collected from grow‐out ponds located at Nellore, Andhra Pradesh, India, showed WSSV negative and positive by PCR using primer sets specific to ORF119 and VP28 gene of WSSV, respectively. This indicated the deletion of genetic fragments in the genome of WSSV. The WSSV isolate along with lab strain of WSSV was subjected to next‐generation sequencing. The sequence analysis revealed a deletion of 13,170 bp at five positions in the genome of WSSV‐NS (new strain) relative to WSSV‐TH and WSSV‐LS (lab strain). The PCR analysis using the ORF's specific primer sets revealed the complete deletion of 10 ORFs in the genome of WSSV‐NS strain. The primer set was designed based on sequence covering ORF161/162/163 to amplify a product of 2,748 bp for WSSV‐LS and 402 bp for WSSV‐NS. Our surveillance programme carried out since 2002 revealed the replacement of WSSV‐LS by WSSV‐NS in Indian shrimp culture system.     

Cloning and characterization of the haemolysin determinants from Aeromonas hydrophila

Abstract. Two haemolysin genes (AHH4 and AHH-2) of Aeromonas hydrophila ATCC7966 were cloned into a plasmid vector in Escherichia coli K-12. An open reading frame (ORF) of the AHH-1 haemolysin gene was 1734 base pairs (bp). and corresponded to a protein of 577 amino acid residues. Analysis of the deduced amino sequence indicated a highly hydrophobic N-terminal region which had the characteristics of a leader peptide. The sequence also included the -10 region and the -35 region of a promoter, and a ribosome- binding site upstream from the ORF. The termination site was located downstream from the ORF. The haemolysin was a thermolabile protein with the predicted molecular mass of 60 kDa. The AHH-1 gene is distributed in various A. hydrophila and A. salmonicida strains. The nucleotide sequence of a 981 bp ORF of the AHH-2 gene was encoded with the predicted molecular mass of 377 kDa polypeptides. The homology of the nucleotide sequence was very low between the AHH-1 and AHH-2 genes, and also with the aerolysin gene cloned by Howard & Buckley (19S6). No leader peptide was found in the N-terminal region of the ORF of the AHH2 gene. The AHH-2 gene was detected in the original strain ATCC7966, but was not detected in other tested strains of A. hydrophila and A. salmonicida.     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。     

刺激隐核虫小GTP酶Ran基因的克隆与表达

对刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的小GTP酶Ran基因(Ci Ran)进行研究,以期为刺激隐核虫病原生物学研究及其防治提供理论基础。从刺激隐核虫滋养体/包囊前期cDNA文库中筛选出Ci Ran基因的克隆,利用生物信息学方法对CiRan基因及其编码的蛋白进行结构与功能的预测;通过逆转录PCR检测CiRan的mRNA。结果表明其在刺激隐核虫的各个发育阶段均有表达。对CiRan基因开放阅读框内的非通用密码子进行改造,并构建重组质粒p GEX-4T-1/CiRan,将其转化到大肠杆菌(E.coli)后成功表达分子量为51.3 kD的重组融合蛋白rCiRan。用rCiRan蛋白免疫鼠血清进行免疫印迹分析,结果表明,抗rCiRan血清能识别刺激隐核虫各期虫体的天然CiRan蛋白,其表观分子量为25.3 kD,与根据编码基因序列推测出的理论值相符;以rCiRan的抗血清做间接免疫荧光抗体实验,结果表明天然CiRan蛋白在幼虫的细胞质和细胞核内均有分布,且在核膜周围富集,佐证了该分子潜在的功能。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白,本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株(下简称CyHV-2)感染异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF),用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化,纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色后,用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示,透射电镜下观察发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒,也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示,抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应,质谱鉴定显示,其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明,通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后,本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。     

Characterization of the monoclonal antibody specific to the ORF72 protein of koi herpesvirus and cellular distribution analysis of the viral protein

Koi herpesvirus (KHV) is an emerging pathogen of koi and common carp that causes a severe disease and mass mortality of infected fish. The KHV ORF72 protein is an important capsid protein that has been suggested to be a candidate for the development of diagnostic reagents and KHV vaccines. The purpose of this study was to clone and express the KHV ORF72 gene for further preparation of a specific monoclonal antibody (mAb) and to analyse cellular distribution of the viral protein. The mAb 3E1 could specifically recognize the expressed ORF72 protein of transfected cells by indirect immunofluorescence, and the antigenic site recognized by the mAb 3E1 was mapped to the region of N-terminal 124 residues of KHV ORF72. This mAb was further demonstrated to specifically detect the KHV-infected fish tissue by immunohistochemistry, thereby suggesting its high diagnostic potential. In addition, the cellular distribution analysis of the KHV ORF72 protein revealed that the region of amino acid residues 125–247 was related to mitochondrial localization and proliferation. Furthermore, a putative nuclear export signal (NES) of ORF72 at the residues 201–212 was confirmed on the basis of its function associated with NES activity.