农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织遗传转化体系的建立

以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料,诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织,用农杆菌(EHA105和LBA4404)介导法转化其愈伤组织.利用本室构建的植物双元表达载体中携带的GUS报告基因对农杆菌转化系统的条件进行了研究,如农杆菌的侵染浓度、菌种类型、侵染时间、A8(乙酰丁香酮)浓度及基因型等,建立了农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织高效遗传转化体系。     

农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究

基因型是影响农杆菌转化植物的主要因素之一,筛选对农杆菌敏感的小麦基因型对于进一步提高小麦转化效率具有重要意义.利用c58C1农杆菌菌系（含GUS基因）感染不同小麦品种的幼穗和幼胚,共培养后进行X-Gluc组织化学染色检测,以筛选对农杆菌敏感的小麦基因型.结果表明,83个小麦基因型的幼穗经农杆菌感染后,GUS基因表达率66.7%～82.8%,CA9924、北农49、西农2611、京冬11等基因型对农杆菌感染比较敏感,多数基因型对农杆菌感染不敏感.80个小麦基因型的幼胚经农杆菌感染后,GUS基因表达率在10.0%以上的基因型仅占3.8%,没有GUS基因表达的基因型多达71.3%,绝大多数基因型对农杆菌感染不敏感;当幼胚与农杆菌的共培养在滤纸上进行时,97H2169、轮选208、兰考906、扬麦6号等基因型对农杆菌感染非常敏感,GUS基因表达率达到50.0%～93.3%,没有GUS基因表达的基因型下降到36.8%.表明不同小麦基因型以及相同基因型的不同外植体对农杆菌的敏感性存在着显著差异,兰考906、扬麦6号、西农2611、京冬11等基因型是农杆菌转化小麦较为理想的受体材料;滤纸上共培养方式更有利于农杆菌对小麦外植体的侵染,GUS基因表达率平均比固体培养基共培养方式高16.6个百分点.     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。     

尾叶桉U6遗传转化再生体系的建立

以桉树品种尾叶桉U6叶盘为外植体,选用MS培养基为基本培养基,附加激素6-BA,IAA,IBA,NAAA,通过研究不同激素浓度组合对外植体愈伤诱导及不定芽分化的影响,建立了较好的遗传转化再生体系.结果表明,尾叶桉U6叶盘最适分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L 2,4-D 1 mg/L IAA 0.2 mg/L 蔗糖30 g/L 琼脂粉5 g/L;小苗的最佳生根培养基为MS NAA 0.2 mg/L mA 0.5 m/L 蔗糖30 g/L 琼脂粉5 g,L.40mg/L卡那霉素可以抑制叶盘的分化;20 mg/L卡那霉素可以抑制再生植株的生根.2种抑菌抗生素中,头孢霉素对叶片再生影响较大;而250 mg/L的羧苄青霉素能有效地抑制农杆菌菌株EHA105的生长,却对尾叶桉叶盘的芽分化影响不大,为适宜的抑菌抗生素.3种农杆菌LBA4404,EHA105,GV3101的菌液浸染桉树叶盘,统计其愈伤组织GUS染色率,以EHA105对外植体的浸染能力最强,达83.3%.     

大豆根部特异性启动子的克隆及功能分析

利用PCR技术从大豆品种吉农17基因组DNA中分离得到大豆根部特异性启动子片段RSP,长度约为2.5kb.序列分析表明RSP与报道序列同源性达97%以上,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pRSP-GUS后,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化炯草(Nicotiana tabacum)NC89.转基因植株的GUS活性检测表明,仅能在根中检测到GUS活性,而在茎、叶和种子等其它组织中都未检测到GUS活性,证实RSP片段具有根部特异性表达功能.     

根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究

为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素。结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等。实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体。菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高。在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%。在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%。     

基于玉米自交系E28的农杆菌介导与基因枪转化体系的建立及比较

以玉米自交系E28的胚性愈伤组织为受体,分别利用农杆菌介导法和基因枪轰击法对携带有GUS基因和Bar基因的质粒进行转化,借助GUS基因的瞬时表达率和抗性愈伤组织比例建立体系,并对两种方法进行比较。农杆菌介导法以OD6000.6、浸染30 min、25℃共培养3 d、加入0.01%的silwet L-77为最佳参数;基因枪轰击法为4.5 MPa、11 cm轰击距离最佳参数。农杆菌介导法与基因枪轰击法的GUS瞬时表达率没有显著差异,基因枪法的抗性愈伤组织比例显著高于农杆菌介导法,基因枪轰击法较农杆菌介导法更有利于获得转基因后代。     

农杆菌介导的籼稻转化研究

系统研究了影响农杆菌转化水稻的主要理化因子,以建立一个农杆菌介导法获得大量转基因籼稻植株的体系。农杆菌EHA101(pIG12Hm)感染后的籼稻Pusa Basmati 1(南亚优质米推广品种)悬浮细胞系经3周选择,其Gus阳性的抗性愈伤组织占感染细胞团总数的比例可达10%左右,最高达21.1%,转化频率有显著提高。用另外两个农杆菌菌株/质粒,EHA105(pCAMBIA1201)、EHA105(pCAMBIA1301)转化该悬浮细胞系的频率均在5%~10%之间。以转化植株的克隆数计算,Basmati 1的转化频率为1%~5%。     

大豆种皮特异性启动子的克隆及功能分析

采用PCR技术从大豆品种吉农17基因组DNA中分离得到大豆种皮特异性启动子片段SCSP,长度约为1268 bp.序列分析表明SCSP与报道序列同源性达97%以上.将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pSCSP-GUS后,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89.转基因植株的GUS活性检测表明,仅能在种皮检测到GUS活性,而在茎、叶和花等其它组织中都未检测到GUS活性,证实SCSP片段具有种皮特异性表达功能.     

大豆悬浮细胞培养及作为外源基因转化受体的研究

以吉林小粒7号大豆品种为材料,切取无菌幼苗下胚轴诱导愈伤组织,初步建立了大豆悬浮细胞系,测定不同硼酸浓度下悬浮细胞生长变化;采用农杆菌介导法对大豆悬浮细胞进行外源GUS基因的转化,先通过不同程度的超声处理确定最佳超声时长,然后在最佳超声处理时长的基础上,探讨了硼酸浓度对转化效率的影响;最后采用PCR和Southern blot杂交对抗性愈伤做分子鉴定。结果表明:大豆悬浮细胞正常生长硼酸浓度在2.0~10 mg·L-1,过高或过低均会抑制大豆细胞正常的生长,高于100 mg·L-1时抑制作用最显著。但在转化过程中,适当增加硼酸浓度(10~30 mg·L-1)则能够提高悬浮细胞的转化效率,并且有助于转化组织的筛选,借以3 min超声的辅助作用,30 mg·L-1硼酸浓度下转化效率达到1 mg转化细胞团中含28个转化体。     

利用注射叶片法快速鉴定大豆GmCRY1和GmCRY2基因功能

将大豆隐花色素基因GmCRY1、GmCRY2构建在N端含有绿色荧光蛋白(GFP)的pEGAD载体上,并转化农杆菌EHA105菌株.将含有上述基因的EHA105菌液分别注射到大豆单叶及复叶叶片中,观察长日条件下(16 h光照/8h黑暗)和短日条件下(8h光照/16 h黑暗)注射植株的开花时间.结果叶片注射含GmCRY1基...     

几种农杆菌的耐酚性能比较与驯化研究

为了明确不同农杆菌菌种对茶多酚的耐受性能变化幅度,以及驯化培养对提高农杆菌茶多酚耐受性、从而提高茶树遗传转化中遗传转化率的作用与可行性,本文比较了茶多酚对四种农杆菌生长的抑制率,进行了耐酚菌株的驯化培养,最后比较了驯化菌株与原始菌株的转化能力。结果表明:茶多酚对几种农杆菌均有明显的生长抑制作用,但不同菌种的耐受性能差异较大;通过驯化培养得到的耐酚菌株EHA105AP,其耐酚性能提高了90.89%,同时,其在茶树叶片和愈伤中的GUS瞬时表达率也分别提高了43.85%和57.55%。     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料，利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段，将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序，结果证明，此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间，构建了植物表达载体pBIFe，并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

Bt基因表达载体的构建及对茶树遗传转化的研究

用限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ从pGA4 71质粒中切取Bt基因并转入载体pCAMBIA2 30 1中 ,构建后的质粒含Bt基因、intron -GUS基因和NPTⅡ基因。将构建后的质粒转化大肠杆菌 ,通过三亲交配法分别导入农杆菌菌株LBA4 4 0 4、EHA10 5、pRi15834中。以茶树叶片、愈伤组织为转化的受体材料 ,用农杆菌介导法将其转入茶树中 ,获得了GUS瞬间表达。以潮霉素作为愈伤组织筛选的选择性试剂 ,效果明显优于卡那霉素 ,适宜浓度为 2 0 μ/ml;以卡那霉素作为茶树叶片材料的筛选试剂 ,50 μ/ml为宜。     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

CaCl2诱导大豆花粉管通道农杆菌转基因研究

为了提高大豆花粉管通道法转基因效率,研究直接用农杆菌转化方法的可行性,以秋大豆品种上海本地青为受体材料,用花粉管通道法在三种CaCl2浓度水平下进行质粒pCAMBIA3301转化,又以GV3101、LBA4404、EHA105三种农杆茵菌株直接导入花粉管通道为处理进行了遗传转化.以质粒为外源基因平均结实率为36.83%,T0代种子平均成活率为60.89%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为8.24%.以农杆菌直接转化平均结实率为15.92%.T0代种子平均成活率为20.40%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为7.79%.对存活的植株提取DNA进行PCR检测,以质粒为外源基因的处理共获得20株转化苗,三种CaCl2浓度水平的转化效率分别为0.56%、1.64%、1.40%,有两种水平的转化效率约为传统转化效率的三倍.以农杆菌直接转化的处理共获得5株转化苗,转化效率分剐为0.17%、0.33%、0.29 %.     

利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。