沙门氏菌和金黄色葡萄球菌DNA提取方法的比较

采用水煮法、试剂盒法、改良CTAB法、DNA提取液法及TEX裂解液法提取沙门氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA,比较5种方法提取的DNA品质,选取适用于农产品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测的DNA提取方法。结果表明,TEX裂解液法提取的DNA纯度高、操作简单、省时省力、成本低,提取的沙门氏菌基因组DNA纯度为1.88,质量浓度为412.6 ng/μL;金黄色葡萄球菌DNA纯度为1.84,质量浓度为366.7 ng/μL。以TEX裂解液法提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,电泳检测扩增产物有清晰的目的条带。     

转基因甘蔗红糖DNA的提取及分子鉴定

随着不同转基因生物(GMO)制品的不断商业化,转基因成分检测技术也需不断更新。由于甘蔗红糖为甘蔗汁经高温熬煮浓缩而成,红糖中残留的DNA降解严重、含量低、片段短,且蛋白及糖分杂质含量高,所以甘蔗红糖DNA是比较难以收集并进行分子检测的。为了在转基因甘蔗红糖商业化前建立起转基因甘蔗红糖DNA的提取及分子鉴定技术,本研究以转基因甘蔗和非转基因甘蔗为材料,模仿传统的红糖制作工艺,分别获得了转基因甘蔗红糖与非转基因甘蔗红糖。通过对DNA提取方法进行改进,设计不同扩增片段长度的引物,并对传统PCR与荧光定量PCR进行比较,建立了稳定的甘蔗红糖DNA的提取方法及外源基因分子鉴定技术该技术对转基因甘蔗红糖与非转基因甘蔗红糖进行准确鉴别,为今后转基因甘蔗红糖的商业化所需的转基因食品鉴定提供技术支持,也为后面更为重要的转基因甘蔗白糖DNA的提取及分子鉴定提供借鉴。     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。     

石油污染土壤总DNA的提取

寻找一种可获得高浓度、大片段的石油污染土壤微生物总DNA的提取方法。分别采用SDS的细胞裂解法、溶菌酶和SDS裂解法、实验室改进法、试剂盒法提取石油污染土壤总DNA。研究结果表明4种方法都可获得石油污染土壤微生物总DNA,但每种方法在提取量和纯度上有一定差异;实验室改进法提取的DNA产率是最高的,试剂盒法提取DNA纯度最高。实验室改进法获得的微生物总DNA,稀释20倍可直接用于PCR扩增。土壤样品经过一定的预处理后提取的DNA片段大小在23100 bp,实验室改进法提取土壤微生物总DNA产率、纯度较好,不经过纯化可直接用于PCR扩增及其他分子生物学实验的操作。     

一种快速高效的油茶叶片DNA提取方法

油茶叶片含有较多的多糖和多酚等次生代谢产物是提取DNA的重要障碍。本研究以油茶叶片为材料研究高质量的DNA提取方法。建立了一种改良的CTAB法,运用2×CTAB缓冲液来裂解细胞,在裂解细胞后的溶液中加入终浓度为2 mol/L Li Cl,用氯仿异戊醇抽提溶液,用等体积的异丙醇沉淀DNA,用预热的70%乙醇洗涤DNA沉淀。运用紫外分析和琼脂糖凝胶电泳分析测定了DNA的产率和质量,并与经典SDS法、经典CTAB法、高盐低p H法进行了对比。结果表明,改良的CTAB法提取的DNA产率比经典SDS的少,与经典CTAB法和高盐低pH法的相似,达到39.0μg/g,且纯度高,无RNA的污染。改良的CTAB法提取的叶片DNA可用于油茶后续的PCR分析研究。     

濒危植物海南龙血树SSR-PCR反应体系优化

为了更好地应用SSR分子标记技术于濒危植物海南龙血树保护遗传学研究,本研究通过单因子试验与正交试验方法,优化建立海南龙血树SSR-PCR反应体系,并对优化后体系的稳定性进行了检测。研究结果表明,优化后的海南龙血树15μL SSR-PCR反应体系为:1.5μL 10×PCR buffer, Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L,d NTPs浓度为100μmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.4μmol/L和DNA模板5 ng。经验证,该反应条件可用于海南龙血树遗传多样性和遗传结构分析。     

基于TksGlfex DNA聚合酶SSR扩增的棉花DNA一步提取法

DNA提取是SSR-PCR检测的前提,但因棉花中富含多酚、多糖和蛋白质等干扰物质,使得提取棉花DNA较其他植物困难,这也导致棉花分子辅助育种明显滞后。本研究探索出适用于SSR技术的一步快速提取棉花DNA的方法。该方法 DNA提取液成份包括0.1 mol/L Na OH、0.7 mmol/L NaCl、20 mmol/Lβ-巯基乙醇、2%SDS和2%PVP。该方法的具体步骤是:将液氮下研磨成粉状的棉花幼嫩叶片,放入含0.5 m L DNA提取液的离心管中。热裂解后加入盐酸离心,取上清,直接用于SSR-PCR扩增。将该方法提取的DNA片段较大,质量较好,能很好地用于TksGlfex DNA聚合酶的SSR-PCR扩增,扩增电泳条带清晰。此棉花DNA提取操作简单、高效,相比传统的棉花DNA提取而言,显著地节约DNA提取时间。     

改良CTAB法用于苹果果实基因组DNA的提取

针对苹果果实多糖、多酚含量高的特性,以成熟期‘澳洲青苹’果实为材料,嫩叶作为对照,采用三种改良CTAB法提取苹果果实基因组DNA。实验表明,方法三提取的DNA效果最佳。该方法综合了多步除杂步骤,即在细胞裂解前加入干扰物清除液,提高β-巯基乙醇、PVP的浓度抑制多酚氧化,沉淀DNA时加入1/10体积3 mol/L Na AC,有效去除了果实中多糖和多酚等物质。紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳表明,提取的DNA纯度较高、完整性好。以所提取的DNA为模板,用ISSR引物进行PCR扩增,条带清晰。Eco RⅠ酶切检测表明,所提的DNA能被完全酶切。因此,确定方法三是适合苹果果实基因组DNA提取的最佳方法,该方法为DNA提取过程中多糖、多酚的去除提供了参考。     

碱解法快速提取菠菜基因组DNA方法的优化

为了优化碱解法提取菠菜基因组DNA的方法,并为大批量育种材料的分子标记筛选奠定基础,本试验以菠菜幼嫩叶片为试材,以PCR扩增效果为主要依据,研究NaOH浓度、水浴温度与方法、吐温20浓度对菠菜DNA提取质量的影响。结果表明：以0.4 mol/L NaOH为提取液研磨后沸水浴1 min提取的菠菜DNA的PCR扩增效果明显好于常温处理。样品不经研磨、可直接用PCR扩增仪99℃、4 min代替沸水浴加温并省去离心步骤,此时以0.4 mol/L NaOH+0.5%吐温20为提取液时PCR扩增效果最佳。提取DNA的A₂₆₀/A₂₃₀比值较高时PCR扩增效果较好,因此A₂₆₀/A₂₃₀比值是评价提取DNA质量的最优指标。本试验优化了碱解法简便快速提取菠菜DNA的技术规程,达到了理想的PCR扩增效果。     

砂珍棘豆ISSR-PCR反应条件优化研究

以砂珍棘豆(Oxytropis racemosa Turcz.)DNA为材料,应用分子标记技术,分析了DNA模板浓度、Mg2 浓度、引物浓度和dNTP浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响,经优化试验建立了砂珍棘豆ISSR-PCR反应体系.20 μL PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:20 ng DNA模板,1 U Taq酶,0.24 μmol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.15 mmol/L dNTPs.     

甘蔗种质总RNA提取方法的研究

甘蔗是重要的糖料及能源作物之一。甘蔗种质RNA的提取是甘蔗分子生物学研究的前提。本实验是以成熟甘蔗的叶片为材料,通过对前人的植物RNA提取方法进行改良,寻求最佳的甘蔗总RNA提取方法。通过改良最后得到的异硫氰酸胍法Ⅲ具有成本低、操作简单、省时等特点。用该法提取得到的甘蔗总RNA经琼脂糖凝胶电泳可获得28S、18S和5S rRNA3条带,并且28S rRNA的亮度大于18S rRNA的亮度。表明该方法提取的RNA完整性好,纯度高。另外对所得部分甘蔗种质的总RNA进行RT-PCR检测,可特异扩增出目标片段,说明用异硫氰酸胍法Ⅲ提取的甘蔗种质总RNA,可以直接用于后续的分子生物学试验。     

基于Kingfisher Flex系统树木叶片RNA的提取方法比较及优化

随着林木功能基因组学的发展,如何快速高效地提取高质量的核酸变得越来越重要。本研究基于Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统,以细叶桉叶片为材料,利用5种磁珠法RNA提取试剂盒(A/B/C/D/E)比较提取RNA的质量和纯度,筛选出试剂盒C为最佳试剂盒。在试剂盒C默认提取程序基础上,利用正交设计L9(34),研究Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统上不同洗涤速度、洗脱速度及时间等机器参数对提取RNA的浓度和纯度的影响。正交试验结果表明,对提取RNA的浓度和纯度影响最大的机器参数是洗涤速度,正交试验最优程序组合下提取RNA的纯度稍优于试剂盒C,但是得率仅为试剂盒C的1/3,综合比较后确认试剂盒C默认程序为提取细叶桉叶片RNA的最优提取程序。另外利用试剂盒C也分别对降香黄檀、大果紫檀、油楠、檀香、黑木相思和柚木这六个树种的叶片RNA进行提取,结果表明提取出的RNA均满足cDNA建库以及转录组测序实验的要求。本研究建立了Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统上树木叶片RNA的高效提取方法,对树木叶片高通量RNA提取有重要的应用价值,并为其他树种在提取RNA程序上对相关参数进行优化和设置提供了参考。     

短芒披碱草SRAP-PCR 体系的建立和优化

通过单因子和正交设计两种试验方法,对短芒披碱草SRAP-PCR体系进行优化,得到短芒披碱草20μL SRAP-PCR最优反应体系为：Mg2＋2.00 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、d NTPs250μmol/L、DNA 30 ng和10×buffer 2μL;各因素水平变化对PCR反应影响从大到小依次是：Mg2＋、引物、Taq酶、d NTPs和模板DNA。运用该优化体系对6份短芒披碱草材料进行验证,电泳结果显示扩增条带多态性高,清晰无杂带。该优化体系的建立有助于将SRAP标记技术用于短芒披碱草的遗传育种等研究。     

余甘子SRAP反应体系的优化

本文报道通过正交设计和单因素优化实验建立余甘子SRAP-PCR优化体系。实验表明PCR反应各因素（模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物）对扩增结果均有不同的影响。采用50 ng模板DNA,2.0 mmol?L-1 Mg2+, 0.4 mmol?L-1 dNTPs, 0.3 μmol?L-1 引物的20 μL反应体系可扩增出最清晰丰富的多样性条带。使用该优化体系检测12份余甘子种质资源样品,结果稳定可信,适用于分子遗传研究。     

辣椒的一种适用于大规模PCR鉴定的DNA快速提取技术

传统的辣椒DNA提取常采用CTAB法,该技术已难满足大量开展分子生物学工作的需要,为了解决此困境,进行了辣椒上碱煮法提取的尝试。一个可用于新品种的SSR分子标记被用作检验手段,验证碱煮法所提DNA是否可满足实验需要。结果表明针对不同的研究目的需采取不同的组织部位来进行DNA的提取,当面临种子纯度测定的任务时,需要截取种子的芽根。当面临成熟植株的基因型筛选的任务时,需要截取植株的顶端嫩叶。以上这些植物材料置PCR管中,在向管中加入80 μL 0.2 mol/L NaOH溶液后,置PCR仪上以100℃处理30分钟, 再以40 μL Tris-HCl缓冲液将pH值调节至7~8之间后,以之为模板可在后续的SSR-PCR中得到良好的实验结果。综上,本研究表明相较其他耗时耗力的传统DNA提取方法,碱煮法确是更适合解决辣椒大规模鉴定问题的技术手段。     

款冬花DNA提取及ISSR体系优化

摘 要：为了从分子水平对款冬种质资源进行鉴定和遗传多样性分析,分别采用SDS法、CTAB法、改良SDS法和改良CTAB法提取款冬叶片基因组DNA,比较不同方法的提取效果,并用改良CTAB法提取的DNA进行ISSR-PCR扩增体系摸索,建立优化的ISSR-PCR反应体系。结果显示：改良SDS法和改良CTAB法都可以提取出高质量的DNA,最优的ISSR-PCR反应条件为: 20μl反应体系中含DNA模板约20ng,Taq 酶1.0 U,Mg2+ 2.00 mmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.6 μmol/L,1×PCR缓冲液。     

紫色观赏辣椒基因组DNA提取及ISSR-PCR体系的优化

摘 要：为探索紫色观赏辣椒基因组DNA的最佳提取条件和建立ISSR-PCR最优反应体系,对比了三种基因组DNA提取方法,并通过正交设计实验优化了ISSR-PCR反应体系。结果表明,采用高盐低pH法从两种观赏辣椒中提取的基因组DNA的A260/A280值分别为1.807和1.818,DNA电泳条带明亮整齐,无拖尾;ISSR-PCR最优反应体系(20 μL)为：1×PCR buffer,1.5 mmol/L Mg2+,0.6 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.0U Taq DNA聚合酶,60 ng模板DNA,扩增所得分子图谱稳定性高、重复性好;唯有高盐低pH法提取的DNA经该ISSR-PCR体系扩增能体现出两个辣椒品种间分子图谱的差异。     

萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对萝卜ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验。研究结果表明,获得了最佳的反应体系,在10μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.6U﹑Mg2+2.0mmo/L﹑模板DNA 40ng﹑dNTP 250μmol/L﹑引物0.25μmol/L﹑10×PCRBuffer,不足部分以ddH2O补足。确立了以UBC876为引物的最优反应条件,退火温度为48℃,总循环数为40次。新优化的萝卜ISSR-PCR的反应体系和程序有很好的重复性和稳定性好。此研究为今后利用ISSR技术对萝卜进行种质资源分类﹑遗传图谱构建和基因定位奠定了基础。