一种适用于辣椒大规模PCR鉴定的DNA快速提取技术

传统辣椒DNA提取常采用CTAB法,该技术已难满足大量开展分子生物学工作的需要,为了解决此困境,进行了辣椒上碱煮法提取的尝试。将待测物置PCR管中,向管中加入80μL 0.2 mol/L Na OH溶液,置PCR仪上以100℃处理30 min,再以40μL Tris-HCl缓冲液将PCR管中溶液调至p H 7~8后,以之为模板可在后续的SSR-PCR中得到良好的实验结果。结果表明针对不同的研究目的需采取不同的组织部位来进行DNA的提取,当面临种子纯度测定的任务时,需要截取种子的芽根。当面临成熟植株的基因型筛选的任务时,需要截取植株的顶端嫩叶。综上,本研究表明相较其他传统的DNA提取方法,碱煮法确是更适合解决辣椒大规模鉴定问题的技术手段。     

种子纯度和品种真实性鉴定中提取玉米DND方法的比较分析

本文通过比较和分析了SSR分子标记技术的三大类DNA提取方法CTAB法、SDS籽粒快速提取法、快速碱煮法，在种子纯度和品种真实性检验中的效果，发现鉴定玉米品种真实性和种子纯度最理想的DNA提取方法是CTAB小量提取DNA法，对于快速检测的理想DNA提取方法是快速碱煮法。     

紫色观赏辣椒基因组DNA提取及ISSR-PCR体系的优化

摘 要：为探索紫色观赏辣椒基因组DNA的最佳提取条件和建立ISSR-PCR最优反应体系,对比了三种基因组DNA提取方法,并通过正交设计实验优化了ISSR-PCR反应体系。结果表明,采用高盐低pH法从两种观赏辣椒中提取的基因组DNA的A260/A280值分别为1.807和1.818,DNA电泳条带明亮整齐,无拖尾;ISSR-PCR最优反应体系(20 μL)为：1×PCR buffer,1.5 mmol/L Mg2+,0.6 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.0U Taq DNA聚合酶,60 ng模板DNA,扩增所得分子图谱稳定性高、重复性好;唯有高盐低pH法提取的DNA经该ISSR-PCR体系扩增能体现出两个辣椒品种间分子图谱的差异。     

甘薯基因组DNA高效快速提取方法

甘薯基因组DNA传统的CTAB提取法,提取DNA质量好,但提取效率不高.为满足甘薯分子标记辅助育种、核心种质和遗传连锁图谱构建以及转基因植株检测的需要,通过对传统的CTAB法进行改进,本研究建立了一种高效快速价廉的甘薯及其近缘野生种基因组DNA提取方法,适合于PCR扩增以及AFLP分析.本方法使用1.5 mL离心管和专用棒槌,整个过程转管1次,提取的DNA主带明显,片段大小一致,得率达5 μg/mg叶片冻干粉.提取质量可靠,RAPD-PCR和酶切后AFLP扩增,与传统CTAB法提取DNA扩增结果没有明显差异.与传统的CTAB方法相比,该方法快速(提取过程不足30 min),效率高,从10 mg叶片冻干粉中一次可提取50 μg左右的DNA模板,操作简便,污染降低,实用性强.     

三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较

用分子标记辅助选择进行精细定位和遗传改良时,首先就需要大批量提取植物DNA,作为PCR反应的模板。水稻基因组DNA常用的简易提取方法有碱处理法和高温水煮法等,本文改进了常规的CTAB方法,提出另一种简便的高质量DNA提取方法,称“简化法”,并比较了这三种方法提取的DNA在数量、质量上的差异,以及作为PCR模板时扩增效果,确定了在精细定位和遗传改良时“简化法”是一种较优的方法。     

表面活性剂LAS在棉花高通量DNA提取中的应用

本研究以棉花种子和叶片为材料,探索一种适用于棉花DNA高通量提取的方法。通过在裂解液中加入APG、LAS、CPB、DTAB、Tween80、SDS和CTAB 7种不同表面活性剂,比较其在棉花种子和叶片中的DNA提取效果,并与磁珠法和氯仿抽提法两种高通量纯化方法结合,对比传统SDS和CTAB提取液提取效果。结果表明,加入LAS表面活性剂的裂解液提取的DNA效果较好,提取棉花种子和叶片的浓度可达2 127.61和572.70 ng/μL,OD260/280分别为1.97和1.98,上清液清澈透明。LAS与两种纯化方式结合的DNA提取效果都明显优于传统CTAB和SDS提取液的提取效果,其中LAS与氯仿抽提的纯化方法结合提取效果最好,且DNA提取通量可达到600个样品/2 h。LAS表面活性剂能在棉花种子和叶片DNA提取中都能起到促进作用,与氯仿抽抽提纯化方法相结合可兼顾DNA提取通量与质量,能满足后续大部分分子实验要求。     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。     

碱解法快速提取菠菜基因组DNA方法的优化

为了优化碱解法提取菠菜基因组DNA的方法,并为大批量育种材料的分子标记筛选奠定基础,本试验以菠菜幼嫩叶片为试材,以PCR扩增效果为主要依据,研究NaOH浓度、水浴温度与方法、吐温20浓度对菠菜DNA提取质量的影响。结果表明：以0.4 mol/L NaOH为提取液研磨后沸水浴1 min提取的菠菜DNA的PCR扩增效果明显好于常温处理。样品不经研磨、可直接用PCR扩增仪99℃、4 min代替沸水浴加温并省去离心步骤,此时以0.4 mol/L NaOH+0.5%吐温20为提取液时PCR扩增效果最佳。提取DNA的A₂₆₀/A₂₃₀比值较高时PCR扩增效果较好,因此A₂₆₀/A₂₃₀比值是评价提取DNA质量的最优指标。本试验优化了碱解法简便快速提取菠菜DNA的技术规程,达到了理想的PCR扩增效果。     

甘蓝型油菜成熟籽粒DNA快速提取方法探讨

以室温保存不同年份的甘蓝型油菜种子为材料,采用改良的CTAB法和DNA抽提试剂盒分别提取甘蓝型油菜籽粒DNA,探讨适合甘蓝型油菜籽粒DNA提取的方法。结果表明,不同保存年份种子提取的DNA含量无显著差异;受种皮色泽的影响也较小;用改良的CTAB法比试剂盒所提DNA产量高,结构完整性好,成本较低。PCR扩增检测结果表明两种方法获得的DNA均能满足一般的分子实验。因此,从油菜干籽粒中直接提取DNA可以节约时间,显著提高工作效率,为快速高效地进行甘蓝型油菜种质资源和遗传多样性分析奠定了基础,同时,也利于快速鉴定推广品种是否带有外源基因。     

生长素和赤霉素对刺果瓜幼苗生长发育的影响

[目的]刺果瓜(Sicyo angulatus L.)是外来入侵植物,对当地生态破坏严重,幼苗期是刺果瓜生命周期相对薄弱环节,研究其幼苗的生长机理,对遏制刺果瓜的繁殖和扩展有很大的帮助。[方法]本试验以刺果瓜幼苗为研究对象,设置四个不同浓度(3 μmol/L、30 μmol/ L、300 μmol/ L、3000 μmol/ L)的生长素(IAA)、生长素抑制剂三碘苯甲酸(TIBA)、赤霉素(GA3)、赤霉素抑制剂矮壮素(CCC)、IAA+GA和TIBA+CCC对刺果瓜长出第一片真叶的幼苗进行处理,通过测量6个时间点( 1天,2天,3天,5天,7天,9天)刺果瓜幼苗的株高、根长、鲜重、干重等生理特性,探究IAA和GA对刺果瓜幼苗的影响。[结果]结果表明：300 μmol/L的IAA处理植株株高与根长长势超过其他试验组与对照组,而3000 μmol/L的TIBA植株株高与根长得到明显的抑制。3000 μmol/L的GA3处理组株高、干重值、鲜重增长速度最快,为刺果瓜的最适浓度范围；3 μmol/L GA3处理,植株增长速度最慢；300 μmol/L CCC对刺果瓜的矮化作用最好,但干重、鲜重值增加；接近3000 μmol/L的CCC矮化作用较好,对干重、鲜重几乎无促进作用,为控制刺果瓜生长的最适浓度范围。浓度为3000 μmol/ L的TIBA+CCC处理对刺果瓜幼苗的影响极为显著,在喷洒激素6 h后就可以看到刺果瓜幼苗受到抑制出现萎蔫,刺果瓜有极强的抗逆性,所以在12 h后萎蔫状态消失,虽然仍受到抑制,但仍然缓慢生长着。9 d后,浓度为3000 μmol/l的TIBA+CCC处理刺果瓜幼苗仅长高5.53 cm,而对照组长高18.70 cm。浓度为3000 μmol/l IAA+GA处理的刺果瓜幼苗长高34.47 cm。浓度为3000 μmol/l的TIBA+CCC对刺果瓜的抑制作用极其显著。[结论]通过研究刺果瓜的生长机理,使用外源激素对刺果瓜的生长有较好的抑制作用,为抵抗外源入侵植物提供了新方法。     

款冬花DNA提取及ISSR体系优化

摘 要：为了从分子水平对款冬种质资源进行鉴定和遗传多样性分析,分别采用SDS法、CTAB法、改良SDS法和改良CTAB法提取款冬叶片基因组DNA,比较不同方法的提取效果,并用改良CTAB法提取的DNA进行ISSR-PCR扩增体系摸索,建立优化的ISSR-PCR反应体系。结果显示：改良SDS法和改良CTAB法都可以提取出高质量的DNA,最优的ISSR-PCR反应条件为: 20μl反应体系中含DNA模板约20ng,Taq 酶1.0 U,Mg2+ 2.00 mmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.6 μmol/L,1×PCR缓冲液。     

胡椒SRAP反应体系的建立和优化

建立并优化胡椒SRAP分子标记体系,为海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析、物种和品种鉴定等打下技术基础。利用单因素随机试验对胡椒SRAP-PCR反应体系中各组分（Taq DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、引物和Mg2+）的浓度进行优化,同时筛选SRAP-PCR反应的循环数和最适退火温度。通过实验确定了SRAP-PCR反应体系为：反应总体系为20 μL,其中引物0.35 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTP 0.6 mmol/L,Mg2 + 1.5 mmol/L,模板DNA 25~200 ng,同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度;最佳SRAP-PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,35℃退火30 s,72℃延伸45 s,5个循环;然后94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸45 s,40个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存。SRAP-PCR体系适为胡椒属植物遗传多样性分析奠定了基础,并成功地应用于海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析。     

树莓基因组DNA的提取及ISSR反应体系的正交优化

摘 要：以树莓优良野生种质插田泡（Rubus coreanus）为材料,比较了SDS法、CTAB法和改良CTAB法提取树莓基因组DNA的效果,结果发现三种方法均能提取到树莓DNA,但改良CTAB法优于CTAB法和SDS法,其所得的DNA质量最好,杂质最少。通过正交试验设计,对Taq酶,primer,dNTP和DNA用量进行了筛选,建立了树莓ISSR技术最优反应体系,即25 μl反应体系中含有1×PCR Buffer,2 mmol/L Mg2+,1.5 U Taq酶,0.2 μmol/L primer,0.4 mmol/L dNTP和20 ng DNA。采用引物UBC835和UBC873分别对10个树莓品种和8个树莓野生资源进行检验发现,该体系工作效果良好。     

一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法

旨在寻求一种微量、快速提取小麦DNA的方法。以小麦幼叶为材料,用改良CTAB法、改良SDS法、沸水浴法提取小麦叶片总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳法、紫外吸收法和PCR检测DNA完整性和纯度。改良CTAB法提取小麦基因组DNA质量和纯度高、无降解,每人每天可以轻松提取200个DNA样品,对转基因植株的PCR检测显示扩增目标条带清晰一致,无假阳性,试验结果理想。改良SDS法所提DNA纯度和浓度虽略不如改良CTAB法,但仍然符合实验要求。沸水浴法提取量少且杂质多,PCR无有效扩增,结果不理想。改良CTAB法提供了一种简便、快速微量小麦DNA提取方法,适用于PCR和其他分子生物学研究。     

长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、300 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.75 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。     

香蕉RAPD反应体系的建立

利用改良的CTAB方法从香蕉叶片中提取高质量的DNA。在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,经过反复试验,确定适合香蕉PCR扩增程序为：94℃预变性 5min;94℃变性 1min;38℃退火 1min;72℃延伸 2min;变性ó延伸,循环45次;最后72℃延伸 2min。PCR扩增的体系（总体积25μL）为：模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,10×PCR Buffer2.5μL,引物0.20μmol/L,Taq酶0.75U,ddH2O17.85μL。     

淮山RAPD-PCR反应体系的建立

摘要：采用改良CTAB法提取淮山的叶片总DNA。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD-PCR扩增结果的影响,建立了适合于淮山RAPD-PCR反应体系,即20μL体系中包括：模板DNA为50 ng、Taq酶为0.2U、Mg2+浓度为3.0mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、dNTPs浓度为0.2mmol/L。     

甜菜SCoT-PCR反应体系的建立及优化

旨在利用SCoT分子标记技术为甜菜指纹图谱构建、遗传多样性分析以及其他分子标记辅助育种提供技术支持。本研究利用单因素实验优化了甜菜SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20 μL反应体系中,甜菜SCoT-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg² ）、10 ng的DNA、0.5 U的Taq DNA聚合酶、10 μmol/L的引物2 μL以及0.1 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。利用优化后的程序对12份糖甜菜品种进行扩增,结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,可用于甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。