巴西橡胶树地上部地下部均一化酵母双杂交cDNA文库构建及评价

缺磷是影响橡胶树产量的主要因素之一,蛋白泛素化在其中发挥了重要作用。为研究泛素化在橡胶树低磷胁迫中的调控作用,本研究分别以巴西橡胶树"热研7-33-97"组培苗地上部和地下部为材料,构建酵母双杂交文库,并对其进行了评价。首先用CTAB法大量提取橡胶树地上部和地下部总RNA,再用PROMEGA试剂盒处理获得纯化的m RNA,然后采用SMART誖技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds-cDNA),继而通过双链特异性核酸酶(DSN)对ds-cDNA进行均一化处理,再经CHROMA SPIN+TE-400柱子纯化长片段的cDNA,最后将获得的长片段cDNA和线性化载体p GADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞,构建均一化酵母双杂交文库。结果显示:地上部文库滴度8×107cfu/m L,插入片段≥0.5 kb的重组率为100%;地下部文库滴度7×107cfu/m L,插入片段≥0.5 kb的重组率为87%。该结果表明文库已成功构建,可以用于进一步实验。     

水分胁迫柠条锦鸡儿叶片均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

柠条是包括内蒙古在内干旱荒漠草原上的优势建群植物,具有极强的耐旱(寒)力,为了研究其抗逆机理,挖掘和利用其抗旱基因,用Trizol法从经过干旱处理的柠条当年新生幼嫩枝叶中提取总RNA,分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录合成双链cDNA,DSN技术进行均一化,构建了柠条全长cDNA文库。经检验,文库的滴度为1.5×106 cfu/mL,重组率为93.75%,90%以上插入片段的长度为1.0～2.0 kb。从文库中随机挑取3200个克隆进行5’测序,得到3020个有效EST,合成2429个unigenes,其中,singlets 2229条,占总有效序列的91.76%,经与数据库比对,发现了脱水素、抗旱相关转录因子等多个抗旱相关基因。     

一种高效提取棉花不同组织总RNA的热硼酸改良法

针对棉花组织中酚类化合物、多糖、次级代谢产物的含量较多,以及内源RNase活性高等特点,将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和氯化锂选择性沉淀RNA步骤偶联在一起,发展成一种有效提取棉花不同组织特别是棉纤维组织总RNA的热硼酸改良法。在提取RNA过程中,不需用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,简化了RNA提取的操作步骤。从不同棉花组织提取的RNA质量均能满足cDNA文库的构建、差异显示、cDNA末端的快速扩增(RACE)以及Northern杂交等分子实验。     

葡萄果实cDNA文库的构建及鉴定

构建葡萄果实cDNA文库是研究果实发育相关基因表达调控的基础工作.本实验从巨峰葡萄果实中提取了高质量的RNA,利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA第一链,用特异引物进行LD-PCR扩增合成双链cDNA.将分级纯化的带有粘性末端双链cDNA与λTrip Ⅰ Ex2载体连接,重组载体体外包埋成为cDNA原始文库.初步鉴定原始文库的滴度为1.32×106 pfu/mL,文库扩增后滴度达1.45×1010 pfu/mL.从扩增文库中随机挑取250个克隆进行PCR鉴定,结果表明重组率为98.7%,插入片段大小在0.5～2.0 kb之间,因此,本研究成功构建了葡萄果实cDNA文库.     

利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA

由于棉花基因组中含有大量的内含子,直接利用由基因组克隆的基因十分困难,目前国内外主要采用由棉花的cDNA作模板克隆基因并进行遗传转化.得到完整的cDNA必须有高质量的RNA,由于棉花组织中棉酚、多糖的含量较高,因此用通用的提取RNA的方法提取棉花RNA比较困难,国内外的许多学者针对棉花的具体情况已经发展形成几种比较有效的棉花总RNA的提取方法,如:高离子强度、高pH值提取法、热CTAB法、异硫氢酸胍法、Trizol reagent kit法、CTAB/酸酚法、热酚法和热硼酸法等;这些方法都能提出棉花的总RNA,但相比较而言,异硫氢酸胍法和Trizol试剂比较昂贵,高离子强度、高pH值提取法步骤繁琐,本文借鉴热CTAB法并进行了改良,提出一套完整可行的提取棉花叶片总RNA的经济简便的方法.     

单叶省藤三种组织RNA提取和全长cDNA文库构建

本实验比较了3种RNA提取方法提取单叶省藤的茎、雄花序和根的结果,改良CTAB法和Trizol法提取的RNA无明显降解、完整性好,均可用于cDNA文库构建,而异硫氰酸胍法提取的RNA降解严重;考虑到改良CTAB法成本较低,故推荐为首选方法。将茎、雄花序和根三种组织的RNA等量混合后,利用SMART策略构建了全长cDNA文库;通过涂平板培养后的菌落计数,测得初库滴度为2.91×105cfu/μL;从培养平板上随机挑取16个菌落进行PCR检测,文库重组率为87.5%,插入片段平均长度为1.5kb左右。所建文库的质量可靠,为下一步的EST测序和候选基因发现提供了材料基础。     

抗草甘膦真菌(Candida palmioleophila)分离鉴定及其cDNA文库构建

利用瓶培养富集技术从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选抗草甘膦菌株,通过菌株形态学鉴定、生理生化特性测定及18S rRNA序列分析,确定其为假丝酵母菌(Candida palmioleophila)。以供试的抗草甘膦菌株总RNA为起始模板,利用Clontech公司的SMARTer技术构建cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.58×106cfu/mL,扩增后文库滴度为3.42×109cfu/mL,文库库容为2.58×106cfu,重组率为97.6%,插入片段范围为500bp~3kb,主要集中在1kb附近。表明构建的TY-JM的cDNA文库质量符合要求。     

制备棉花幼蕾高质量总RNA的方法比较

 以棉花和烟草的叶片及幼蕾为材料，分别用Trizol法和热硼酸/蛋白酶K法提取总RNA，对获得总RNA的量和纯度测定。结果表明，热硼酸/蛋白酶K法提取棉花幼蕾总RNA效果最好，得到的RNA具有质量高、完整性好等优点     

棉花高质量RNA的提取及MADS-box基因保守区段的克隆

研究和探讨了一种可用于高质量棉花总RNA提取的热硼酸法,并用于棉花MADS box基因的RT PCR分析,结果表明,该方法制备的RNA质量较高,克隆得到的基因片段序列与已知MADS box基因序列之间具有较高同源性。     

巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳cDNA文库的构建

摘要：以巴西橡胶树热研7-33-97为材料,对橡胶树割线下方施用0.1%茉莉酸,采集胶乳,提取胶乳总RNA并纯化mRNA,构建巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳融合表达文库。检测表明,获得的初级文库滴度为1.9×106 pfu/ml,插入片段在0.5到5kb之间,平均大小为1kb左右;表明该文库质量合格,为今后克隆胶乳中的茉莉酸信号应答基因奠定基础。     

陆地棉开花后20d纤维抑制性消减文库的构建及分析

本研究以高比强度纤维材料0-153和转基因抗虫棉sGK9708为亲本构建的高代重组自交系群体(F6:9)中选育出的高比强度纤维品系(69307)作为材料,利用抑制性消减杂交技术,以15DPA纤维为driver、20DPA纤维为tester,成功构建出陆地棉开花后20d纤维的cDNA消减文库。通过蓝白斑筛选、菌落PCR及反向Northern技术最终筛选出差异表达的阳性克隆340个。通过对阳性克隆测序及序列分析,共得到115个单一序列,其中35个重叠群,80个单拷贝。利用Blast2GO等对差异表达基因进行生物信息学分析,结果表明这些差异表达基因广泛参与糖类、脂类、氨基酸等物质的代谢,以及纤维素生物合成、细胞壁合成与修饰、氧化还原、细胞信号转导等生物学过程。     

杂交鹅掌楸体胚发生中胚性细胞总RNA提取

本实验通过比较改良SDS法、Trizol法和设计的改良CTAB法对杂交鹅掌楸体胚发生过程总RNA的提取结果,杂交鹅掌楸体胚发生过程总RNA提取最佳体系为:最佳试材的用量为0.25～0.5g,氯仿:异戊醇(24:1)抽提3次,终浓度2mol/L的LiCl与2倍体积的无水乙醇依次沉淀RNA。该体系提取的总RNA质量高,无降解,无污染。反转录后合成的cDNA第一链分子量大小分布在100～1500bp之间,可以满足下一步实验要求。并以此第一链成功进行了RT-PCR。     

棉花内生拮抗菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1抗黄萎病研究

 在棉花现蕾期筛选到一个高抗黄萎病的内生菌菌株,根据16S rDNA序列同源性,将其命名为Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1(解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1)。当把该菌标记后,每株棉花施用该菌株达到1×10⁶ cfu时,该菌能顺利定殖于棉花体内。室内盆栽抗病实验表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁶,1×10⁷,1×10⁸ cfu,其在结铃期的发病株率仅为8%,5%和2%,而此时对照的发病株率高达96%。2008－2009年的小区防治结果表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁸ cfu时,2008年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为14.8%和8.5,对照分别为53.3%和26.5,2009年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为9.4%和6.5,对照为37.8%和18.8。这些结果表明,解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1对防治棉花黄萎病具有巨大的应用潜力。     

3种奶牛乳房炎主要病原菌的PCR检测方法建立

奶牛乳房炎是影响奶业健康发展的一种重要细菌性疾病,迫切需要建立一种敏感、特异的检测方法,以实现奶牛乳房炎的快速、准确诊断。现根据奶牛乳房炎主要致病菌16~23S rRNA之间的序列设计引物,建立检测金黄色葡萄球菌,无乳链球菌,停乳链球菌等3种奶牛乳房炎主要致病菌的PCR检测方法。用建立好的PCR检测方法对临床患病奶牛获取的31份样品进行特异性和敏感性检测。结果显示：PCR检测方法能快速、特异地检测出3种奶牛乳房炎主要致病菌,从而确定致病菌型。对金黄色葡萄球菌,无乳链球菌,停乳链球菌的检测灵敏度分别为1×106 cfu/mL、1×106 cfu/mL、1×103 cfu/mL。因此,该方法可作为一种常规检测的替代方法。     

一种适合于cDNA文库构建的高质量棉花RNA的简单抽提法

Duetothelargeamountsofpolyphenolicsandpolysaccharides,theextractionofhighqualitybiochemicalmoleculeslikeRNAand DNAisalwaysanobstacletothemolecularbiologystudyofcotton.TheconventionalRNAextractionmethodsandcommercialkits alwaysfailedtogethighqualityRNAorevennothing.PerfectRNA wasextractedfromembryogeniccallusincottonusingTrizol(Invitrogen,#15596026)butfailedtoothertissuesinthisstudy.Hereamodifiedsimpleprotocolwasdescribedusingguanidinium thiocyanatetoextracthighqualityRNAfromcottonwithl…