水稻胁迫应答基因OsABI8的克隆与表达分析

利用拟南芥abscisic acid-insensitive8(ABI8)基因的序列在NCBI核酸数据库中检索到水稻ABI8的序列信息,并设计特异性引物,以水稻cDNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出水稻ABI8 cDNA序列.将所得序列片段克隆到T载体上并进行序列测定,结果显示,该基因全长1 666 bp,开放阅读框927 bp,编码一个308个氨基酸的蛋白.该蛋白序列与普通小麦、一粒小麦、玉米、高粱、拟南芥菜等植物的ABI8基因序列高度同源,分别达到86.1%、86.4%、89.6%、90.3%及72.5%的一致性.利用荧光定量PCR法检测了QsABI8基因在ABA激素、干旱和盐胁迫下的表达谱,发现胁迫下植物积累更多的QsABI8 mRNA.     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

百合无症病毒衣壳蛋白基因克隆和蛋白分析

根据已报道的LSV CP基因序列合成两条寡聚核苷酸引物,模板为感染LSV的百合叶片的总RNA,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出大小为876bp的LSV CP基因,经测序后,对该基因编码区全长序列及相应的氨基酸序列用生物信息学软件系统进行序列分析及结构功能预测.结果表明:该基因由876个核苷酸组成,编码291个氨基酸;与GeneBank公布的其他LSV分离物的基因序列同源性为93.4%～99.0%,氨基酸同源性为84.8%～99.5%;它含有一个卷曲螺旋结构和多个磷酸化位点,平均疏水值为-0.432;含有Carlaviruses完整的衣壳蛋白保守结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主.     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

十字花科部分蔬菜HRD基因的克隆与生物信息学分析

根据NCBI上得到的拟南芥HRD基因序列,利用同源序列克隆的方法,设计引物,从12种十字花科蔬菜中克隆出其核酸序列,并进行生物信息学分析,旨在验证克隆出的序列与拟南芥HRD基因是否具有同源性.对这些得到的核酸序列从DNA序列、氨基酸序列的相似性、亲/疏水性、2级结构、功能域、3级结构、同源进化树等进行了预测和较为全面的分析.结果显示经PCR扩增,都得到了大小与拟南芥HRD基因基本一致的序列,长度在555bp左右.其基因序列、氨基酸序列比对同源性分别达到93.14%和89.74%;亲/疏水性分析表明该基因编码的蛋白为亲水性蛋白;推导的氨基酸序列中均存在AP2功能结构域,属于十字花科AP2/ERF类家族转录因子基因;同源进化树分析表明它们具有很高的同源性,说明所克隆的序列与拟南芥HRD基因由同一个基因进化而来,是十字花科植物中的保守基因.     

藏鸡A-FABP基因和H-FABP基因的克隆及生物学信息分析

以藏鸡为研究对象,根据NCBI上登录的原鸡A-FABP和H-FABP基因序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆藏鸡A-FABP和H-FABP基因的CDS区,并进行生物信息学分析.结果表明:藏鸡A-FABP和H-FABP基因的ORF分别为399 bp、402 bp,编码132、133个氨基酸;A-FABP和H-FABP分子量分别为14.91ku、14.84ku,等电点分别为6.34、5.92,均为亲水蛋白,无信号肽和跨膜结构.磷酸化位点分别有9、6个,O糖基化位点分别有10、5个;藏鸡A-FABP和H-FABP的氨基酸序列与原鸡的同源性最高,分别为99%、100%,在鸟类动物中序列比较保守.     

工业枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因克隆及分析

以工业用枯草杆菌为样品,根据对已发表的碱性蛋白酶基因信息设计简并引物,PCR扩增克隆碱性蛋白酶基因。结果:获得1100bp的完整基因序列,该基因编码363个氨基酸残基的蛋白质序列;测序结果经blastx同源比对后,与已报道碱性蛋白酶基因相似性高度一致。     

粗毛栓菌atp9基因的克隆、表达及序列分析

ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与多种氧化磷酸化和光合磷酸化反应.atp9基因是ATP合酶的重要组成部分,其编码了ATP合酶A亚基上第9亚单位,与呼吸作用和光合作用密切相关.本研究利用atp9基因在进化过程中高度保守的特点,据已知近缘真菌基因序列,设计并合成了一对引物,以粗毛栓菌mRNA反转录得到的cDNA第一链为模板,PCR扩增得到atp9基因完整序列,并连接于原核表达载体pET32a(+)上.测序与序列分析表明:该克隆片段全长222 bp,共编码73个氨基酸,翻译的蛋白质分子量是7.35 kDa.转化大肠杆菌后经IPTG诱导,可高效表达外源融合蛋白,分子量大小与预测结果一致.经过同源比对和进化树分析,该克隆基因编码的氨基酸序列与可可丛枝病菌(Crinipellis perniciosa)和瓣环栓菌(Trametes cingulata strain ATCC 26747)中相对应的氨基酸序列相似度最高.本实验为未来进一步研究粗毛栓菌atp9基因和其蛋白功能,阐明其调控和作用机制奠定了基础.     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genescan软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.     

药用植物黄花蒿ATP合成酶电子克隆及生物信息学分析

本文通过电子克隆的方法获得黄花蒿ATP合成酶的基因完整序列并对该蛋白特性进行相应分析.以Accession number KJ434435.1为探针,对黄花蒿的EST数据库进行搜索,获得同源较高的序列,用相关生物软件DNAMAN、MEGA进行拼接组装,并对获得核苷酸和氨基酸进行生物信息学分析.结果发现获得黄花蒿ATP合成酶基因拼接群1963bp,含有一个完整的开放阅读框(ORF)序列(1479bp),编码492个氨基酸,该蛋白质含15个α螺旋,23个β折叠及27个无规则卷曲.黄花蒿ATP合成酶蛋白的分子质量为52830.4,分子式为C_(2342)H_(3778)N_(636)O_(721)S_(14),理论等电点为5.18,该蛋白的GRAVY值为-0.048,具有亲水性的水溶性蛋白.该蛋白质序列有丝氨酸磷酸化位点(Ser)9个、苏氨酸磷酸化位点(Thr)6个、酪氨酸磷酸化位点(Tyr)4个.通过分析获得黄花蒿ATP合成酶完整的c DNA序列,该氨基酸序列不存在信号肽,无跨膜现象、非分泌型蛋白,为黄花蒿ATP合成酶实验室研究提供一定的理论基础.     

家蚕中一未知基因的生物信息学分析

对家蚕中一未知基因进行生物信息学分析,结果显示：该基因开放阅读框大小为858bp,编码285个氨基酸,预测分子量为31．1kD,等电点为4．75;该基因编码蛋白含有TPR（Tetratrico Peptide Repeat）结构域,具有个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、肉豆蔻酰基化位点、糖基化位点及cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化功能位点。     

水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及检测

以水稻（粳稻）cDNA为模板,设计一对特异性引物,获得编码水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的全序列,ORF区编码含535个氨基酸的蛋白,具有磷酸盐转运蛋白保守的蛋白激酶C作用位点、N端糖基化位点与酪蛋白激酶Ⅱ作用位点Southern blot分析显示此基因在水稻基因组中具有多个拷贝,与水稻基因组序列分析结果一致Westernblot预测目的基因表达的蛋白大小约为57．7ku．该基因的真核表达研究正在进行中．     

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT—PCR技术,首次从大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS 24（Ribosomal Protein S24）基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析．结果表明：大熊猫RPS24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框（ORF）为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15．3251kD,pI为10．92,含有7种类型共14个功能位点：即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e signature．进一步分析发现,大熊猫RP524基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性：编码序列同源性分别为94．1％、92．4％、94．7％、89．9％和90．4％;与人RPS24蛋白的氨基酸序列同源性为98．48％,其余均为99．24％．     

马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的生物信息学初步分析

本文根据马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的EST序列,运用多种生物信息学方法,对其进行初步的生物信息学分析.电子克隆获得了该基因的全长,结果表明:该序列全长1 742 bp,共编码357个氨基酸,有多个限制性酶切位点,有多个磷酸化位点,属于亲水性氨基酸,无信号肽,有膜穿透性.通过蛋白质二级结构功能域的预测,发现该序列中含有11个功能位点.通过蛋白质同源序列比对,发现该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因相似度极高,暗示该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因具有相似的生物学功能.以上结果可以为进一步研究该基因在马铃薯中特别是在抗青枯病分子育种中的功能提供相关依据.     

多枝赖草Glutathione Reductase基因克隆及胁迫表达分析

为了获得完整的谷胱甘肽还原酶基因序列,根据已克隆到的谷胱甘肽还原酶cDNA片段设计引物,利用RACE扩增获得了基因全长序列,应用Southern印迹杂交法分析基因存在状态,Northern印迹杂交法研究基因表达情况.结果表明,该基因全长1 580 bp,含一个1 140 bp的开放阅读框架,编码380个氨基酸,与其它植物谷胱甘肽还原酶氨基酸序列的同源性在77%-92%之间;Southern杂交表明该基因有一个拷贝;Northern杂交表明在逆境胁迫下GR基因表达加强.     

一个紫红曲霉HR-PKS基因MpER1的克隆及序列分析

利用已知HR-PKS中ER结构域的保守氨基酸序列,通过设计简并引物,并使用本实验设计的巢式PCR方法从紫红曲霉(Monascus purpureus)中成功克隆得到一条长约300 bp的ER基因片段MpER1,再用Genome Walking的方法获得该HR-PKS中ER的基因全长序列.序列分析显示:该ER基因长为936 bp,编码312个氨基酸.将该ER基因序列与已知的ER基因序列比对,发现不同产物的ER基因同源性较差.该ER基因对应的氨基酸序列与A.clavatus 有最高的同源性,为88%.与其他物种如Nectria haematococca、Magnaporthe grisea等有50%左右的同源性.     

拟茎点霉全局性调控因子veA基因的克隆及鉴定

克隆及鉴定了1株抗肿瘤聚酮去乙酰基真菌环氧二烯(DAM)高产菌株拟茎点霉G818的全局性调控因子veA基因.根据已发现的VeA同源蛋白序列,选取N端保守区域设计简并引物,利用常规PCR及LA-PCR技术获得veA基因序列,然后结合Softberry软件和NCBI数据库分析确定出veA基因的ORF.克隆得到的veA基因,存在1个大小为64 bp的内含子,能够编码381个氨基酸.veA基因的成功克隆为后续RNA干扰菌株的构建及VeA在DAM的生物合成过程中所起作用的探究奠定基础.     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆是随着EST计划和生物信息学发展起来的基因克隆策略。运用电子克隆的方法获得甘蔗S-APX2基因。以水稻中一个基因OsAPX2为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行预测和分析。获得一个甘蔗APX基因S-APX2的cDNA序列全长,该序列长1110bp,包含一个完整的975bp的ORF,编码324个氨基酸;属于疏水性蛋白,编码蛋白含有Heme binding site,Substrate binding site,K+binding site,Ascorbate-peroxidase结合位点和保守域,属于Plant-peroxidase-like Superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于植物细胞的线粒体中。具有5个丝氨酸磷酸化位点,9个苏氨酸磷酸化位点以及1个酪氨酸磷酸化位点;存在信号肽但是无跨膜结构域,二级结构由30.74%α螺旋、13.92%延伸链和40%无规则卷曲组成;且与水稻、玉米等其他植物的APX具有高度的同源性。电子克隆获得了完整的甘蔗APX基因全长cDNA。