血清(1-3)-β-D-葡聚糖检测对深部

探讨血清(1-3)-β-D-葡聚糖检测对深部真菌感染患者的诊断价值及临床意义,应用MB—80微生物动态快速检测系统,及GKT—5MSet动态真菌检测试剂盒定量检测血清中(1-3)-β-D-葡聚糖的含量,从而统计出待检标本深部真菌感染的阳性率。结果60例可疑深部真菌感染患者,经传统培养方法诊断28例阳性,32例阴性,阳性率为46.7%;经血清(1-3)-β-D-葡聚糖检测33例阳性,12例为可疑感染,阳性率为55.0%,20例健康对照组均为阴性。说明血清(1-3)-β-D-葡聚糖检测较传统的真菌分离、培养与鉴定方法简便,快速,阳性率高,可用于深部真菌感染的早期诊断。     

东亚三角涡虫Dj14-3-3ε原核表达及鉴定

从东亚三角涡虫cDNA文库中挑选出克隆M455,经BLASTP确定隶属于14-3-3ε基因家族,具有14-3-3蛋白的保守结构域命名为Dj14-3-3ε基因.该基因含有完整的最大开放阅读框(ORF),编码蛋白约10.7 kDa.构建pET28b-Dj14-3-3ε原核表达载体,通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达,western blot鉴定,表明原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中正常表达.     

人源性14-3-3σ真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人源性14-3-3σ真核表达载体pCMV-Myc-SFN,并观察其在真核细胞中的表达。方法：通过反转录-聚合酶链反应从HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）中获得编码14-3-3σ的cDNA,定向克隆至真核表达载体pCMV-Myc中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内14-3-3σ的表达。结果：构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,将其转染HeLa细胞48h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内14-3-3σ的表达显著增高。结论：成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,为研究14-3-3σ在上皮细胞源性肿瘤中的作用奠定了基础。     

神经元τ蛋白过度磷酸化时14-3-3ξ的变化

为探讨τ(tau)蛋白异常磷酸化时神经元内14-3-3e蛋白含量的变化，采用GF-109203X和wortmannin联合注射大鼠侧脑室，诱导大鼠海马神经元τ蛋白发生过度磷酸化，同时观察14-3-3e蛋白含量的改变，结果显示：GF-109203X和wortmannin诱导了海马CA3区神经元τ蛋白在Ser396/404位点的过度磷酸化，同时14-3-3ξ蛋白的含量显著增高，这些结果提示τ蛋白过度磷酸化与抗凋亡蛋白14-3-3之间可能的内在联系。     

口腔扁平苔藓中Caspase-3和PTEN 蛋白的免疫组织化学观察

目的：探讨Caspase-3和FIEN蛋白在口腔扁平苔藓病变发生发展中的作用及两者间的关系。方法：采用S—P免疫组化方法对28例口腔扁平苔藓及5例正常口腔黏膜中Caspase-3和PTEN蛋白表达进行检测。结果：口腔扁平苔藓病损中Caspase-3的阳性率上皮层和固有层均为100％，与正常口腔黏膜相比，表达有显著统计学意义（P〈0．01）。口腔扁平苔藓病损中PTEN蛋白阳性率为100％，与正常口腔黏膜相比，无统计学差异（P〉0．05）。口腔扁平苔藓中Caspase-3与PTEN蛋白表达呈正相关，（P〈0．05）。结论：Caspase-3和PTEN蛋白均参与口腔扁平苔藓病变的发生及发展过程，且两者之间具有相关性。     

本氏烟β-1,3-半乳糖苷转移酶基因鉴定、进化及表达分析

β-1,3-半乳糖苷转移酶(beta-1,3-galactosyltransferase,β-1,3-GalT)是植物中特有的酶,作为蛋白质糖基化修饰通路中的重要酶,它可以催化β-1,3键将半乳糖苷转移至糖核心.本研究将本氏烟(Nicotiana benthamiana)作为材料,对其基因组中β-1,3-GalT同源基因进行了系统的鉴定,共得到12个基因.这些基因编码的蛋白序列均包含保守结构域PF00337和PF01762.将本氏烟12个β-1,3-GalT基因与栽培烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的β-1,3-GalT基因进行聚类分析,表明它们分化为2个主要枝(I和II),每个主要枝又进一步分化为2个亚枝.多数基因在根中表达量均较高,然而仅有6个基因在叶片中高表达.采用qRT-PCR,测定在叶片中高表达的6个β-1,3-GalT基因在农杆菌侵染情形下的表达水平,结果表明处于II枝上的基因表达均受到农杆菌侵染的显著诱导,而处于I枝上的基因无论对农杆菌侵染还是对照重悬液的注射,均表现一定程度的表达量的升高,暗示创伤胁迫可能使相应的基因表达升高,从而促进β-1,3-GalT酶进行糖基化修饰反应.     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

14-3-3及Bcl-2蛋白在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的通过检测14-3-3和Bcl-2蛋白在人脑胶质瘤中的表达情况,探讨其在胶质瘤发生、发展中的作用机制.方法采用免疫组化S-P法对5例正常脑组织标本和68例人脑胶质瘤标本进行14-3-3和Bcl-2蛋白检测.结果与正常脑组织比较,14-3-3蛋白在胶质瘤表达异常增强(P0.05);在不同病理分级中胶质瘤组织表达无统计学意义(P0.05),随着胶质瘤恶性程度的增加,14-3-3蛋白表达的强度和范围增加(P0.05).Bcl-2蛋白在不同级别的恶性胶质瘤中阳性表达率有差别(P0.05),且表达强度随着胶质瘤病理分级增高呈明显增高趋势.结论 14-3-3和Bcl-2蛋白对胶质瘤的恶性程度、肿瘤的病理分级有影响,可作为指导临床病理诊断及分级的参考指标.     

S-3-1的癌预防与治疗作用及机理研究

S-3-1是合成丹参水溶性活性成分的中间体,为一新化合物。我们的研究表明,S-3-1不仅对肿瘤有预防作用而且有较强的治疗作用。其预防作用,在体外可抑制苯并芘诱导的V79细胞恶性转化,在体内对DMBA/巴豆油诱发的小鼠皮肤乳头状瘤形成呈明显的抑制作用。作用机理研究表明可能与其较强的抗氧化、抑制ODC产生和增强细胞间隙信息传导有关;抗肿瘤作用,在体外可明显抑制SCLC、A549、KB、HCT-8、PLA-C、BGC、W1-38、CACO2和PaCa的生长。在体内对小鼠Lewis肺癌、S180肉瘤和H22肝癌均呈不同程度的抑制作用。抗肿瘤作用机理研究表明,可能与增加肿瘤细胞间隙信息传导、抑制肿瘤细胞膜P21ras蛋白表达、抑制癌基因C-myc表达、增强抑癌基因P53表达和抑制酪氨酸激酶磷酸化有关。     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

TGF-β1/Smads细胞因子在硬皮病皮肤组织上的表达研究

应用免疫组织化学SP法测定38例硬皮病患者活检皮肤组织和10例正常活检皮肤组织TGF-β1、Smad/3、Smad4、Smad7表达含量，并结合病例临床资料加以分析.实验结果表明，硬皮病患者组活检皮肤组织的TGF-β1、Smad2/3、Smad4表达量显著高于正常皮肤对照组；硬皮病患者组活检皮肤组织的Smad7表达量低于正常对照；在硬皮病患者组内活检皮肤组织TGF-β1、Smad2/3、Smad4和Smad7表达量与患者病情分类、分期、合并有无其他结缔组织疾病没有差异.提示TGF-β1/Smads信号传导     

重组小鼠14-3-3蛋白theta亚型的构建

目的 克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备该蛋白质的基因重组蛋白质.方法 参照小鼠14-3-3蛋白质θ亚型mRNA结构设计引物,以小鼠脑总RNA为模板,RT-PCR法克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,插入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)使其表达谷胱甘肽S转移酶(GST)为标签的融合蛋白质,以凝血酶定点分解融合蛋白并采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的 蛋白.结果 RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离可见约800 bp条带,序列分析表明重组质粒pGEX-1433theta中的插入子为738 bp,编码245个氨基酸,其核苷酸及氨基酸序列与Pubmed NM-011739展示的结果一致.重组质粒pGEX-1433theta在BL21(DE3)中的表达量随IPTG诱导时间递增,融合蛋白质为可溶性组分.亲和层析纯化的14-3-3theta在SDS-PAGE上表现为单一条带,表观相对分子质量为30 ku.每L培养菌液可收获4mg基因重组型小鼠14-3-3theta.结论 克隆了编码小鼠14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备了高纯度基因重组型小鼠14-3-3theta,为进行单克隆抗体的制备奠定了坚实的基础.     

毫米波干预软骨细胞β-catenin活性作用机制研究

为了探讨毫米波干预软骨细胞β-catenin活性的作用机制，采集雄性4周龄SD大鼠膝关节软骨，采用机械-Ⅱ型胶原酶消化，建立体外培养软骨细胞．甲苯胺蓝染色鉴定。第2代软骨细胞培养48h，用不含血清DMEM饥饿24h，更换为10％FBS DMEM，随机分为4组：正常组、实验1组（毫米波干预30min）、实验2组（毫米波干预60min）和实验3组（毫米波干预120min）。各实验组毫米波干预后，培养24h。Ⅱ型胶原免疫组化观察各组软骨细胞的功能，RT—PCR检测β-catenin、GSK-3β、CKIε mRNA表达。Western Blot检测β-catenin、GSK-3β、CKIε蛋白表达水平。结果表明。机械-Ⅱ型胶原酶消化法，能够成功建立体外培养的软骨细胞，第2代软骨细胞培养3d，甲苯胺蓝染色可见软骨细胞内呈紫红色异染颗粒，细胞周围也出现紫红色异染颗粒。细胞核呈深蓝色，以圆形、椭圆形为主；干预前后，各组软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化均可见胞浆呈棕黄色。核呈圆形不着色；实验2组、实验3组软骨细胞β-catenin、CKIε mRNA表达显著高于正常组（P〈0．01），实验2组、实验3组软骨细胞β-catenin、CKIεmRNA表达显著高于实验1组（P〈0．01），实验2组、实验3组软骨细胞肛catenin、CKIε蛋白表达水平显著高于正常组（P〈0．01），实验2组、实验3组软骨细胞／3-catenin、CKIε蛋白表达水平显著高于实验1组（P〈0．01）；实验2组、实验3组软骨细胞GSK-3βmRNA表达显著低于正常组（P〈0．01）。实验2组、实验3组软骨细胞GSK—3βmRNA表达显著低于实验1组（P〈0．05），实验2组、实验3组软骨细胞GSK—3β蛋白表达水平显著低于正常组（P〈0．01）。实验2组、实验3组软骨细胞GSK-3β蛋白表达水平显著低于实验1组（P〈0．01）。毫米波的能量可通过生物体的谐振而被吸收。生物系统谐振吸收电磁能量后又产生了不属于温度变化的生物学效应。干扰生物体的信号传导。动态调节软骨细胞的生物学功能，毫米波作用机制可能是通过诱导软骨细胞转录合成β-catenin、CKIε，抑制GSK-3β表达。从而促进β-catenin合成、抑制分解，提高软骨细胞内β-catenin的活性，并且能维持软骨细胞表型的稳定。     

一步法RT—PCR检测石蜡包埋滑膜肉瘤中SYT—SSX融合基因的表达

运用一步法RT－PCR技术检测14例石蜡包埋滑膜肉瘤组织中t(x;18）(p11.2;q11.2）染色体易位所致的融合基因SYT－SSXmRNA的表达,尤文氏肉瘤和恶性黑色素瘤各一例做对照。结果表明,14例滑膜肉瘤中12例有SYT－SSX融合基因的表达（85．7％）,尤文氏肉瘤和恶性黑色素瘤均有阴性。     

禾谷炭疽菌14-3-3蛋白生物信息学分析

禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等粮食作物而引起的炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失.14-3-3蛋白普遍存在于真核生物,参与植物众多生理生化过程.本研究基于酿酒酵母中2个典型14-3-3蛋白序列,利用Blastp以及关键词对炭疽菌属蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析,明确该菌存在2个典型的14-3-3蛋白;同时,通过对上述蛋白进行二级结构、疏水性、信号肽,跨膜结构域以及亚细胞定位等生物信息学分析.该研究为深入开展禾谷炭疽菌14-3-3蛋白功能研究打下坚实的理论基础.     

对氯苯甲酸3-羟基-4-（3-羟基-3-对氯苯基丙烯酰）-苯基酯合钴（Ⅱ）配合物的微波固相合成及晶体结构

以对氯苯甲酸3-羟基-4-（3-羟基-3-对氯苯基丙烯酰）葫E酯和六水氯化钴为原料,在微波辅助作用下,固相合成了对氯苯甲酸3-羟基-4-（3-羟基-3-对氯苯基丙烯酰）-苯基酯合钴（Ⅱ）配合物．利用红外光谱及单晶X射线法对目标配合物进行了表征,该配合物为三斜晶系,空间群为P-1,晶体学参数：α=0．69450（5）nm,b=1．311610（12）nm,c=1．484090（13）nm,α=105．812（2）°,β=102．4600（10）°,γ=105．326（2）°,F（000）=525,Z=1,V=1．19262（9）nm°,Dc=1．426g·cm^-3,Mr=1024．51,最终结构偏离因子R=0．0527,Rw=0．1058,S=1．052,最终差值电子云密度的最大值和最小值分别为1157nm^-3和-256nm^-3．     

转化生长因子β1及Smad2/3、4在糖尿病肾脏的动态表达及意义研究

目的观察1型糖尿病大鼠转化生长因子131（TGF-β1）及信号转导蛋白Smad2/3、Smad4蛋白在肾脏的动态表达,探讨它们在糖尿病肾病（DN）发生发展中的作用及其相互关系。方法实验动物随机分为5组,依病程长短分为①A组（2周组）,②B组（4周组）,③组（8周组）,④D组（16周组）,⑤E组（24周组）,每组分别设有正常对照组（N组）和糖尿病组（DM组）。采用尾静脉注射链脲菌素（STZ）法复制糖尿病大鼠模型;免疫组织化学方法检测肾脏TGF-131、Smad2/3、Smad4及纤连蛋白（FN）的表达;PAS染色光镜观察肾小球系膜、肾小管基底膜变化及细胞外基质沉积情况等的形态学改变;生化方法测定血糖、血肌酐及24h尿蛋白量。结果正常对照组大鼠肾脏TGF-β1极少表达,Smad2/3、Smad4有少量表达,而糖尿病大鼠三者的表达均显著高于正常对照组;随糖尿病进展,肾组织纤连蛋白表达及24h尿蛋白都增多;糖尿病16周时肾脏TGF-β1表达分别与Smad2/3、Smad4及FN、24h蛋白尿均呈正相关关系。结论STZ-1型糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和下游信号转导蛋白Smad2/3、Smad4参与了肾病时肾脏肥大硬化的发生。     

苯甲酸3-羟基-4-（3-羟基-3-苯基丙烯酰）-苯酯合锌（Ⅱ）配合物的微波固相合成及晶体结构

以苯甲酸3-羟基-4-（3-羟基-3-苯基丙烯酰）-苯酯和醋酸锌为原料,在微波辅助作用下固相合成了苯甲酸3-羟基-4-（3-羟基-3-苯基丙烯酰）-苯酯合锌（Ⅱ）配合物.利用红外光谱及单晶X射线法对目标化合物进行了表征.结果显示,该配合物为三斜晶系,空间群为P-1,晶体学参数：a=0.716 9（7）nm,b=0.939 8（2）nm,c=1.645 6（5）nm;α=106.584（2）°,β=95.591 0（10）°,γ=90.988 0（10）°;F（000）=456,Z=1,V=1.056 5（3）nm3,Dc=1.377g.cm^-3,Mr=876.19.最终结构偏离因子R=0.040 3,Rw=0.094 1,S=1.022.最终差值电子密度的最大值和最小值分别为282nm-3和-334nm-3.     

β-环糊精与3-十二烷氧-2-羟丙基三甲基氯化铵的包结作用

用表面张力法和电导法测定了不同温度下β-环糊精(β-CD)与阳离子表面活性剂3-十二烷氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵(R12TAC)的包结作用．结果表明，β-CD使R12TAC溶液的表面张力升高，最大可接近水的表面张力值．β-CD与R12TAC主要形成1：1的包结物．实验体系的表观临界胶束浓度(cmc^*)与β-CD呈线性关系．298、303和308K时的包结常数分别为2360、2780和3050L／mol．根据Van’t Hoff方程计算的包结过程的热力学参数证明，包结过程主要来自于熵驱动     

2-氯-吲哚-3-甲醛的烷基化反应研究

以2-氯-吲哚-3-甲醛（1）为原料，在碱性条件下发生烷基化反应，对反应的烷基化试剂、溶剂等因素对收率的影响进行了研究，以较高收率合成了N-取代-2-氯-3-吲哚醛类化合物（2a-2e），其中化合物（2a-2e）均是未见文献报道的新化合物。所有新化合物的结构通过红外光谱、质谱及核磁共振氢谱得以证实。