肝癌胰岛素样生长因子II基因启动子P3甲基化的检测及意义

目的:建立检测肝癌胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因启动子P3甲基化状态的方法.方法:培养三株肝癌细胞系(BEL7402、SMMC7721、HepG2),选取正常肝组织3例;提取基因组DNA,亚硫酸氢钠修饰,巢式聚合酶链反应(nested PCR)加甲基化特异性PCR(MSP)检测IGF-II基因启动子P3的甲基化状态,PCR产物经克隆、测序验证.结果:三株肝癌细胞系IGF-II基因启动子P3去甲基化,正常肝组织IGF-II基因启动子P3甲基化,目的片段无突变,甲基化修饰完全.结论:巢式PCR加甲基化特异性PCR可准确检测IGF-II基因启动子P3的甲基化状态.     

肝癌胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子P3甲基化的检测及意义

目的：建立检测肝癌胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因启动子P3甲基化状态的方法。方法：培养三株肝癌细胞系(BEL7402、SMMC7721、HepG2)，选取正常肝组织3例；提取基因组DNA，亚硫酸氢钠修饰，巢式聚合酶链反应(nested PCR)加甲基化特异性PCR(MSP)检测IGF-Ⅱ基因启动子P3的甲基化状态，PCR产物经克隆、测序验证。结果：三株肝癌细胞系IGF-Ⅱ基因启动子P3去甲基化，正常肝组织IGF-Ⅱ基因启动子P3甲基化，目的片段无突变，甲基化修饰完全。结论：巢式PCR加甲基化特异性PCR可准确检测IGF-Ⅱ基因启动子P3的甲基化状态。     

人原发性肝癌中p16,p15基因CpG岛甲基化研究

目的　检测人原发性肝癌中 p16和 p15基因 5’启动子区CpG岛的异常甲基化 ,并分析其与人原发性肝癌发生发展的关系 ,探索其在临床早期基因诊断和治疗中的意义 .方法　用敏感的甲基化特异性PCR检测 2 0例人原发性肝癌患者癌组织、癌旁组织和远癌正常组织中p16 ,p15基因5’CpG岛的甲基化状况 ,统计分析这两个基因 5’CpG岛甲基化与肝癌病理特征的相关性 .结果　2 0例原发性肝癌肝癌组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 5 %(13/2 0 )和 5 0 %(10 /2 0 )异常甲基化 ;癌旁组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 0 %(12例 )和 4 0 %(8例 )异常甲基化 ;远癌正常组织中p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 35 %(7例 )和 2 5 %(5例 )异常甲基化 .p16 ,p15基因 5’CpG岛甲基化在癌组织和癌组织旁、癌组织和远癌组织中均有相关性 .两个基因 5’CpG岛异常甲基化与临床病理特征无显著相关性 .结论　p16和 p15基因 5’CpG岛异常甲基化在人原发性肝癌中频率很高 ,可能在肝癌发生发展中扮演了重要角色 ;而...     

高温胁迫对近江牡蛎Hsp90表达及CpG甲基化的影响

为了丰富广温性潮间带底栖生物的温度调控机制研究,本研究采用荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐处理基因组DNA结合甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)法及染色质免疫共沉淀法,对40℃热胁迫24h后,近江牡蛎(Crassostrea rivularis)热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)的mRNA表达及其核心启动子甲基化的调控模式进行研究。结果显示:近江牡蛎成贝在40℃热胁迫24h后,其消化腺、腮和心脏组织中Hsp90mRNA表达显著升高(P0.05),核心启动子区CpG平均甲基化水平显著降低(P0.05),其中邻近热休克元件(Heat shock element,HSE)的CpG2、CpG3、CpG4位点甲基化水平显著降低(P0.05),CpG5位点甲基化水平无显著变化(P0.05),灰度分析显示消化腺和心脏组织中的Hsp90核心启动子与RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)结合增强,腮组织中的Hsp90核心启动子与RNA polymeraseⅡ出现弱结合。表明Hsp90是近江牡蛎抵御高温胁迫的主要表达基因。     

转基因猪细胞中CMV启动子区域甲基化的研究

为研究转基因猪外源基因表达与启动子区域甲基化的关系,利用流式细胞仪检测体外传代至第5、10和15代的转基因猪成纤维细胞中EGFP荧光强度的变化情况;采用亚硫酸盐测序的方法对这3代细胞CMV IE启动子区域30个Cp G岛的甲基化程度进行测定。结果显示细胞从第5代培养到第10代时荧光变弱,但是当继续培养到15代时EGFP荧光又渐渐变强,但EGFP阳性细胞的比例没有发生变化,均为100%。第5、10、15代细胞启动子区域的Cp G岛甲基化阳性率分别为3.64%±1.25、2.97%±1.03和1.65%±0.74,统计结果表明3代细胞间的甲基化阳性率差异不显著(P0.05)。表明转基猪成纤维细胞中CMV启动子区域的甲基化程度随着体外培养时间的变化不明显,与EGFP的表达水平变化无明显相关。     

牙龈癌PTEN基因启动子区甲基化状态与鳞癌分级的分析研究

探讨第10号染色体丢失性的磷酸酶——张力蛋白同源基因(PTEN)启动子甲基化水平和蛋白表达水平与牙龈癌癌症细胞分化程度的关系。用甲基化特异性PCR法检测牙龈癌组织中PTEN基因启动子甲基化的状态,免疫组化法检测石蜡组织中PTEN的蛋白表达情况。结果牙龈癌组织中发生PTEN基因甲基化的频率为56.67%,其中高分化组甲基化频率为20%,中分化组为50%,低分化组为100%,组间差异具有统计学意义(P0.05),PTEN甲基化频率与其细胞分化程度密切相关。说明牙龈癌中PTEN基因可出现启动子甲基化,且低分化组牙龈癌PTEN甲基化频率更高,同时细胞内PTEN蛋白表达显著下调甚至缺失,为牙龈癌的靶向治疗提供线索。     

褐飞虱乙酰胆碱酯酶启动子的克隆及表观遗传分析

褐飞虱Nilaparvata lugens是水稻的重要害虫之一.本研究旨在扩增褐飞虱乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)基因的启动子,并从表观遗传学的角度探讨DNA甲基化与褐飞虱生物型进化间的关系.采用染色体步移(genome walking)方法扩增AChE启动子,根据所得启动子序列设计甲基化特异性PCR(MS-PCR)引物和重亚硫酸盐测序法BSP引物,分析褐飞虱生物型Ⅰ和生物型Ⅱ中AChE启动子的甲基化程度,然后利用荧光定量PCR技术检测AChE的表达水平差异.结果表明,扩增得到褐飞虱AChE上游侧翼DNA序列长度为1 919 bp,启动子元件分析显示,AChE启动子区域中有若干与MYB、WRKY、ARE等抗性相关转录因子的结合位点(元件),表明该启动子可能与逆境胁迫相关.基于甲基化水平的限制酶酶切位点分析发现,AChE启动子区域含有多个~(5m)CG甲基化位点,表明该区域DNA甲基化主要发生在胞嘧啶的C-5位.MS-PCR分析表明,生物型Ⅰ褐飞虱AChE启动子区域的甲基化程度高于生物型Ⅱ; BSP结果显示生物型Ⅰ启动子区域总体平均甲基化频率(24. 09%)高于生物型Ⅱ(7. 27%);实时定量PCR结果显示,AChE在生物型Ⅱ中的表达量高于生物型Ⅰ.本研究克隆得到AChE启动子序列,并证实褐飞虱生物型间AChE的表达存在差异,且启动子区域高甲基化水平可能是导致AChE低表达的原因之一.     

甲状腺乳头状癌RASSF1A启动子异常甲基化的检测

为了研究甲状腺乳头状癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态,探讨其甲基化与临床参数之间的关系,运用甲基化特异性PCR(MSP)技术,对51例甲状腺乳头状癌组织及10例正常甲状腺组织中RASSF1A基因的甲基化状况进行分析。结果表明:甲状腺乳头状癌组织中RASSF1A基因甲基化率为68.6%(35/51),而正常甲状腺组织中未检测到该基因的甲基化,两者之间的差异有统计学意义(P<0.05);RASSF1A基因甲基化与患者年龄、性别无相关性与肿瘤的浸润和转移有相关性,差异有统计学意义(P<0.05)。因此,RASSF1A基因甲基化是甲状腺乳头状癌组织中常见的分子生物学事件,在腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。     

血清叶酸水平及叶酸代谢相关酶基因多态性与不明原因复发性流产发病的相关性

为探讨血清叶酸水平及叶酸代谢相关酶基因多态性与不明原因复发性流产(URSA)发病的相关性,将78例URSA患者设为观察组,59例健康体检非妊娠妇女设为对照组。采用化学发光法测定血清叶酸、红细胞叶酸水平,时间分辨荧光免疫分析法测定血清维生素B12水平,荧光定量PCR技术检测叶酸代谢相关酶MTHFR基因C677T位点和MTRR基因A66G位点单核苷酸多态性(SNP)。采用Pearson相关性分析血清叶酸、红细胞叶酸、血清维生素B12水平及MTHFR、MTRR基因多态性与URSA发病的相关性。结果显示:观察组血清叶酸水平显著高于对照组(P0.05),血清红细胞叶酸、维生素B12水平显著低于对照组(P0.05)。观察组MTHFR基因C677T位点CC型基因频率显著高于对照组(P0.05),CT、TT型基因频率显著低于对照组(P0.05)。Pearson相关性分析结果表明:URSA发病与MTRR基因A66G位点基因型频率均无相关性(P0.05),与血清叶酸水平和MTHFR基因C677T位点CC型基因频率呈显著正相关性(P0.05),与红细胞叶酸、血清维生素B12水平及MTHFR基因C677T位点CT、TT型基因频率呈显著负相关性(P0.05)。因此,血清叶酸水平及叶酸代谢相关酶基因多态性与URSA发病具有相关性,其中MTHFR基因C677T位点基因突变是URSA发病的危险因素,可作为预测URSA发病的一个生物学指标。     

新疆维吾尔族妇女宫颈癌NKX6-1基因甲基化检测

为探讨NKX6-1基因启动子甲基化与HPV16感染在新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生中的作用。收集43例新疆维吾尔族妇女正常宫颈组织、30例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和48例宫颈癌组织。采用PCR方法检测HPV16感染;甲基化特异性PCR方法检测NKX6-1基因启动子区甲基化状况,并分析启动子甲基化与HPV16感染与宫颈癌的相关性。结果显示,正常宫颈组,CIN和宫颈癌组中的NKX6-1基因甲基化率分别为11.63%、46.67%和77.08%,差异有统计学意义(P0.01);HPV16的感染率分别为13.95%,36.67%和66.66%,三组差异均有统计学意义(P0.01)。NKX6-1甲基化与HPV16感染无显著相关性(P0.05)。由此可知,NKX6-1基因启动子甲基化与HPV16感染无相关性,但与维吾尔族宫颈癌发生相关。     

EphB1在结直肠癌中的差异表达及其临床病理学意义

通过检测结肠癌细胞系和结直肠癌组织中EphB1表达及其与临床病理特征之间的关系和启动子区域CpG岛的甲基化情况,探讨EphB1在结直肠癌中的作用及其机制,为结直肠癌的基因治疗寻找新的靶基因.取5株结肠癌细胞系和61例配对液氮冻存及对应石蜡包埋组织,运用实时定量RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测EphB1 mRNA和蛋白质表达;同时对mRNA表达下调标本进行启动子区域CpG岛甲基化检测.结果显示,5株结肠癌细胞系中EphB1 mRNA均有表达,并且表达存在差异;61例结直肠癌组织与癌旁正常黏膜相比,EphB1 mRNA和蛋白质表达均存在差异.EphB1 mRNA在31.1%(19/61)的癌组织中下调,52.5%(32/61)上调,EphB1 mRNA低表达和组织分化差异有统计学意义(P=0.008).EphB1蛋白在正常肠黏膜和部分肿瘤细胞中呈阳性表达,下调表达62.3%(38/61),上调表达24.6%(15/61);EphB1蛋白的低表达和组织分化(P=0.033)、浸润深度(P=0.038)、性别(P=0.028)以及部位(P=0.039)间差异都有统计学意义.甲基化特异性PCR检测发现EphB1m...     

SFRP1基因启动子区甲基化与宫颈癌及癌前病变的相关性研究

应用MassARRAY DNA甲基化定量分析方法检测58例宫颈癌组织、57例CIN2/3组织、36例CIN1组织及28例正常对照组织中SFRP1基因启动子区各CpG位点甲基化,探讨SFRP1基因启动子区甲基化与宫颈癌演进及与HPV16感染的相关性。结果显示:2110个CpG单位中甲基化率低于30%的CpG单位1612个,占总数的76.4%;甲基化率大于80%的CpG单位为4.4%,多分布于CIN2/3和宫颈癌组织之中。其中SFRP1基因启动子区CpG12.13和CpG18位点的甲基化率宫颈癌组高于对照、CIN1和CIN2/3组,差异具有统计学意义(P0.05)。CpG12.13和CpG18位点甲基化率与HPV16感染无相关性(P0.05)。提示SFRP1基因在CpG12.13和CpG18位点上高甲基化可能与宫颈癌的演进相关。     

福建汉族人胰岛素样生长因子受体基因多态性与非小细胞肺癌易感性的研究

目的:探讨胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)基因多态性与福建汉族人非小细胞肺癌(NSCLC)易感性的关系.方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和DNA测序方法检测福建籍汉族NSCLC患者260例和健康人258例的IGF-1R+1013和IGF-2R+1619两个位点的等位基因分布,探讨不同基因型与NSCLC发病的关系.结果:IGF-1R+1013(G/A)基因型和各等位基因的频率在两组中分布有显著性差异(P＜0.05),与GG基因型者相比,GA、AA基因型者NSCLC患病风险均显著增加(P＜ 0.05),未发现IGF-2R+1619 (G/A)位点各基因型和等位基因的频率分布在两组中的差异有统计学意义(P＞0.05).根据病理类型分层分析发现,IGF-1R+1013 (G/A)变异等位基因A携带者(GA+AA)患肺鳞癌、腺癌、其他类型肺癌的风险增加2.20倍、0.55倍、0.96倍(P＜0.05).未发现IGF-1R+1013、IGF-2R+1619两基因多态性与临床分期、淋巴结转移、远处转移有关(P＞0.05).两基因多态性的联合分析显示,同时携带IGF-1R+1013 (G/A)和IGF-2R+1619(G/A)A等位基因者NSCLC的患病风险增加(P=0.003).结论:IGF-1R+1013 (G/A)中,变异等位基因A是肺癌发生的危险因素,IGF-1R+1013 (G/A)和IGF-2R+1619 (G/A)基因多态性对肺癌的易感性有协同作用.     

C57小鼠胸腺和睾丸中mPer1基因启动子区CpGs甲基化分析

利用实时定量PCR方法检测胸腺和睾丸组织中mper1基因表达时相特点,采用亚硫氢酸修饰法对两种组织两个时间点该基因2个启动子区域5个E-box CpGs甲基化情况进行研究.结果显示:C57 BL/6J小鼠胸腺和睾丸组织中mPer1基因表达没有显著波动性,mPer1基因启动子区CpGs呈低甲基化状态(<10%).两种组织中E3和E4甲基化频率存在显著差异(P<0.01).在睾丸中,不同时间点E3和E4甲基化频率有显著变化(P<0.01).说明在睾丸中,mPer1启动子E-box3的甲基化状态能够随时间波动.但在胸腺和睾丸中,甲基化并不是mPer1基因调节的主要方式.     

C57小鼠胸腺和睾丸中roPer1基因启动子区CpGs甲基化分析

利用实时定量PCR方法检测胸腺和睾丸组织中roPer1基因表达时相特点,采用亚硫氢酸修饰法对两种组织两个时间点该基因2个启动子区域5个E-boxCpGs甲基化情况进行研究．结果显示：C57BL／6J小鼠胸腺和睾丸组织中mnrl基因表达没有显著波动性,roPer1基因启动子区CpGs呈低甲基化状态（〈10％）．两种组织中E3和E4甲基化频率存在显著差异（P〈0．01）．在睾丸中,不同时间点E3和E4甲基化频率有显著变化（P〈0．01）．说明在睾丸中,roPer1启动子E-box3的甲基化状态能够随时间波动．但在胸腺和睾丸中,甲基化并不是roPer1基因调节的主要方式．     

CADM1基因甲基化与宫颈鳞癌及癌前病变的相关性研究

探讨CADM1 基因甲基化与宫颈鳞癌及癌前病变发生的相关性.采用MassARRY EpiTYPER DNA甲基化分析技术定量分析宫颈鳞癌(n=49)、CIN2/3(n=47)、CIN1(n=28)、正常对照组(n=24)中CADM1 基因启动子区15个CpG位点的甲基化状态.宫颈鳞癌组CADM1基因启动子区CpG_1、CpG_ 8、CpG_11、 CpG_15位点甲基化率高于CIN2/3、CIN1及正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),CIN2/3、CIN1及正常对照组间甲基化率差异没有统计学意义(P>0.05).CADM1基因CpG_ 8、CpG_11、 CpG_15甲基化率与HPV16感染呈正相关.CADM1基因特异性位点CpG_1、CpG_ 8、CpG_11、 CpG_15的甲基化可能促进了宫颈鳞癌的发生、发展,其中CpG_ 8、CpG_11、 CpG_15的甲基化可能与HPV永生化到致瘤型表型的转化有关.CADM1基因特异性CpG位点甲基化状态的改变可能导致基因转录表达沉默,是宫颈鳞癌发生发展的促进因素.     

抑制肿瘤小G蛋白ARHI研究进展

小GTP结合蛋白在细胞的整个生命活动中起着重要的作用.人类ARHI基因是小GTP结合蛋白中Ras亚家族的一个成员.系母系印迹基因,定位于染色体lp31.ARHI基因含有两个外显子和一个内含子,启动子区域有转录抑制因子E2F结合位点、3'末端有Au-rich区域.在ARHI基因中存在三个CpG岛,其中第一个CpG岛位于该基因的启动子区域,第二个CpG岛跨越了启动子和第一个外显子区.第三个CpV岛处于第二个外显子之内.与正常细胞相比,ARHI基因在肿瘤细胞中表达受到抑制,其原因为ARHI基因的杂合缺失,CpG岛的异常甲基化,转录抑制因子增多和多聚组蛋白脱乙酰化酶表达加强等.ARHI通过需钙蛋白酶途径诱导细胞凋亡;通过与STAT3(信号转导与转录激活因子3)的结合阻滞癌变.     

新疆维吾尔族人TNFβ-804基因多态性与乙型肝炎易感性的相关性研究

目的:研究TNF-β基因单核苷酸多态性(SNP)804位点与新疆地区维吾尔族人乙型肝炎之间的关系。方法:用套式PCR(nested PCR)和等位基因特异性PCR(allele一speciicfic PCR,AS-PCR)法,对120例乙肝患者和120例正常对照者TNF-β基因SNP804多态性位点进行基因分型。结果:SNP804多态性位点C/C基因型和C/A+AA基因型频率在病例组为77%和23%,正常对照组为88%和12%,两组间基因型和等位基因频率分布差异有显著性(p<0.05)。结论:TNF-β804多态性位点与新疆维吾尔族人乙肝有明显相关性。     

豫南地区汉族人群类风湿关节炎患者IL-18基因启动子-607C/A多态性检测

采用序列特异性引物的聚合酶链反应技术(PCR-SSP)分析110例类风湿关节炎(RA)患者和100例健康体检者的IL-18基因启动子在-607位点的单个核苷酸多态性,检测豫南地区汉族人群白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)基因启动子单个核苷酸多态性与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发生是否存在关联.结果表明,RA患者组与健康对照组在IL-18基因-607位点的等位基因频率的分布及基因型频率的分布比较差异均有统计学意义(χ2=8.668、4.225,P<0.05),抗CCP抗体阳性组和阴性组在IL-18基因-607位点的基因型频率分布差异没有统计意义(χ2=0.941,P>0.05),说明IL-18基因启动子-607位点的多态性与RA患者类风湿因子存在关联.     

G9a对TMS1基因表观调控作用的研究

为探究组蛋白H3K9me2催化酶G9a对甲基化诱导静止基因1(Target of Methylation induced gene Silencing 1, TMS1)的表观调控作用, 通过染色质免疫共沉淀实验检测G9a在TMS1基因启动子区域的结合情况, 然后构建shRNA表达载体转入细胞敲低G9a, 检测TMS1启动子区域组蛋白H3K9me2修饰程度与TMS1 mRNA表达水平.研究结果显示G9a在TMS1基因启动子区域有结合, 敲低G9a后, TMS1基因启动子区域H3K9me2抑制性修饰程度降低, TMS1 mRNA表达水平上升.此结果表明G9a可能通过在TMS1基因启动子区域产生H3K9me2抑制性修饰的方式参与了TMS1基因的表观调控.