TGF-β1对人肝癌细胞系凋亡的调控作用研究

目的肝细胞对TGF-β1敏感性的丧失据认为是肝癌重要的致病因素之一。本研究旨在明确人肝肿瘤细胞系中TGF-β1的作用及其与凋亡的关系。方法选用三种含不同p53基因状态的人肝肿瘤细胞系,应用脱氧核糖核苷酸末瑞转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝肿瘤细胞的凋亡进行定量检测。结果在应用TUNEL检测三个细胞系中,TGF-β1仅能诱导Hep3B细胞(缺失p53)则凋亡较少。这提示凋亡p53基因的表达具有明确的联系。结论HepG2细胞系比Huh-7和Hep3B系细胞更易发生TGF-β1诱导的凋亡,TGF-β1通过p53依赖性途径诱导肝癌细胞系发生凋亡。     

肝癌细胞自噬性凋亡过程中caspase-3基因的克隆与鉴定

目的从长春新碱诱导发生自噬性凋亡的肝癌细胞系HepG2中克隆caspase-3基因。方法提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增目的片段,构建重组克隆载体,测序鉴定及分析。结果经RT-PCR获得了预期的扩增产物即caspase-3基因625bp的核苷酸片段,其测序结果与文献报道一致。结论初步证明该caspase-3基因片段参与了长春新碱诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程。     

RevTet-Off系统调控凋亡素基因在人肝癌细胞表达的研究

目的 应用RevTet-Off系统，于体外观察四环素调节下凋亡素基因的表达及其对人肝癌细胞系HepG2的作用。方法 将RevTet-Off基因调控系统的调节质粒pRevTet-Off和含凋亡素基因的重组表达质粒载体pRevTRE-VP3分别转染PT67细胞，包装出RevTet-Off和RevTRE-VP3重组逆转录病毒，依次将此两种病毒感染HepG2细胞，建立整合了RevTet-Off和RevTRE-VP3重组逆转录病毒的阳性细胞株HepG2／Off-VP3。通过四环素调节凋亡素基因在HepG2／Off-VP3中的表达，Annexin V-FITC／PI双染色后，以流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 经RT-PCR证实凋亡素基因在HepG2／Off-VP3-8细胞得到了表达；HepG2细胞在无四环素环境下的细胞凋亡率明显高于1μg／mL四环素环境下的凋亡率。结论 凋亡素基因经RevTet-Off系统导入HepG2细胞后，可在四环素调控下表达产生凋亡素并诱导细胞凋亡。     

二乙酰去水卫矛醇联合野生型p53基因诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用

目的 实验通过转染野生型p53基因与应用二乙酰去水卫矛醇(1，2：5，6-Dianhydro-3，4-diacetylgalactitol，DADAG)联合作用于肝癌BEL-7404细胞，来研究p53基因联合二乙酰去水卫矛醇诱导肝癌BEL-7404细胞的凋亡作用。方法野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌BEL-7404细胞，同时加入DADAG作用。96h后，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．6％、转染pUHD10-3组为3．9％、用DADAG处理组为29.4％、转染pUHD10-3-p53组为35.3％、转染p53基因及用DADAG处理组为59．8％。结论野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌BEL-7404细胞发生凋亡，转染野生型p53基因与DADAG联合作用，有促进肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用。     

补骨脂酚通过MAPK途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的:研究补骨脂酚对人肝癌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:应用噻唑蓝法（MTT法）和倒置显微镜技术考察补骨脂酚对HepG2细胞生长的影响；采用荧光显微镜观察补骨脂酚处理后细胞凋亡；利用蛋白免疫印迹法检测补骨脂酚对HepG2细胞中凋亡相关蛋白及MAPK家族蛋白表达的影响；引入MAPK家族蛋白抑制剂考察生长抑制率和凋亡相关蛋白表达的变化。结果:补骨脂酚可以剂量依赖性地抑制人肝癌HepG2细胞增殖，其生长抑制作用明显强于临床上常用的抗肿瘤药5-氟尿嘧啶，并且补骨脂酚对人正常肝L02细胞具有较低的毒性。进一步研究发现，补骨脂酚可以诱导HepG2细胞发生凋亡。此外，MAPK家族参与到补骨脂酚诱导的HepG2细胞凋亡过程中，补骨脂酚可以剂量依赖性激活JNK的表达发挥促凋亡的作用，同时抑制了ERK促存活通路，然而对p38无明显影响。结论:本研究首次阐明了补骨脂酚诱导人肝癌HepG2细胞生长抑制作用机制，为进一步的临床应用提供了理论依据。     

罗格列酮诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中p38MAPK通路的作用北大核心CSCD

目的研究罗格列酮对人肝癌HepG2细胞增殖与凋亡的影响,探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路相关蛋白在其中发挥的作用。方法 MTT法检测罗格列酮对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态变化,Western blot检测p38MAPK通路相关蛋白表达变化。结果罗格列酮可抑制HepG2细胞的增殖,诱导细胞凋亡(P<0.05);电子显微镜下可观察到典型的HepG2细胞凋亡表现。Western blot结果显示罗格列酮可激活p38MAPK通路,上调HepG2细胞中磷酸化p53及Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达(P<0.05);而细胞外信号调节激酶ERK1/2的磷酸化程度没有明显改变。p38MAPK通路抑制剂SB203580可显著降低罗格列酮诱导的HepG2细胞的凋亡率;并且SB203580可部分逆转由罗格列酮引发的磷酸化p53、Bax及Bcl-2蛋白的表达变化。结论罗格列酮可通过激活p38MAPK通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,其机制可能与p38MAPK通路参与磷酸化p53、Bax及Bcl-2蛋白的调控有关。     

野生型p53基因与双脱水二乙酰卫矛醇联合诱导肝癌HLE细胞凋亡的研究

背景和目的：p53基因是抑癌基因,研究发现在人类肿瘤中p53基因常发生突变。实验证明野生型p53基因不但抑制肿瘤细胞增殖,而且诱导肿瘤细胞凋亡。但是,单独应用野生型p53基因诱导肿瘤细胞凋亡的作用不很明显。因此,野生型p53基因与药物的联合作用来提高肿瘤细胞凋亡率是目前对肿瘤研究的一新领域。本实验通过转染野生型p53基因联合双脱水二乙酰卫矛醇(1,2：5,6-dianhydro-3,4-diacetylgalactitol,DADAG)作用于肝癌细胞株HLE,研究联合诱导肿瘤细胞的凋亡作用。方法：野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株HLE,同时加入DADAG。96h后,用流式细胞仪、DNA电泳方法进行细胞凋亡分析。结果：流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．4％、转染pUHD10-3组为3．5％、DADAG处理组为32．6％、转染pUHD10-3-p53组为43．4％、转染p53基因及DADAG处理组为74．6％。DNA电泳发现,转染p53基因及DADAG处理组有到DNA梯形条带。结论：野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌细胞HLE发生凋亡,转染野生型p53基因与DADAG联合作用,有促进肝癌细胞凋亡的作用。     

肝癌靶向性腺病毒载体的构建及其作用的研究

背景与目的:抑癌基因p16是肿瘤基因治疗最常用的治疗基因之一,通过腺病毒载体介导p16基因表达引发肿瘤细胞凋亡在多种p16基因失活的肿瘤细胞系中都得到了证实。研究表明,p16在人原发性肝细胞癌中存在高频率失活。因此,本研究通过观察外源性p16基因经AFP启动子驱动表达后对AFP阳性肝癌细胞的影响,以探讨p16基因在肝癌靶向基因治疗中应用的可行性。方法:将外源性p16基因置于人AFP核心启动子AF0.3下游,构建了携带p16基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-AFP-p16,感染肝癌细胞后,应用MTT比色法、Westernblot、DNA片段化分析、流式细胞术分析等方法在体外研究外源性p16基因表达对细胞生长的影响。小鼠皮下接种感染重组腺病毒的鼠肝癌细胞H22,观察病毒对肝癌细胞体内成瘤性的影响。结果:感染Ad-AFP-p16的肝癌细胞高效表达P16蛋白,MTT结果显示细胞生长受到明显抑制,到第六天Ad-AFP-p16对肝癌细胞Bel-7402和HepG2的生长抑制率分别为(94.42±11.70)%和(94.99±6.74)%,DNA片段化分析和流式细胞术分析证实p16能诱导肝癌细胞发生显著凋亡,感染后48hBel-7402和HepG2的凋亡率分别为39.57%和39.75%。感染Ad-AFP-p16的肝癌细胞体内成瘤受到明显抑制,对照组、Ad-GFP组、Ad-AFP-p16组以及Ad-CMV-p16组瘤体体积分别为(1.54±0.65)cm3、(1.71±1.01)cm3、(0.25±0.39)cm3和(0.25±0.45)cm3。结论:AFP启动子驱动p16基因表达可以诱导肝癌细胞发生凋亡。     

转化生长因子β1对人肝癌细胞的作用机制研究

目的：研究肿中TGF－β信号转导调节是否有助于肝癌的发生。方法：利用Northern blot,Western blot、免疫组化等方法研究TGF－β1的产生和生物学作用，特别是激活Smad2、3、4，诱导起相反作用的Smad（6，7）及其启动子的产生，并激活两个靶基因，即PAⅠ-1,p15，结果：肝癌细胞系HCC－M、HCC－T细胞中，TGF－β加速了它的增殖。Smad2通过自分泌的作用不断被激活，因为在缺乏外源性TGF－β，Smad2磷酸化水平增高，诱导PAⅠ-1转,当并发现了Smad2在核中的定位。Smad2连续激活至少部分有助于阻碍TGF－β诱导Smad2的作用。Smad通过TGF－β不断抑制p15的表达。结论：p15基因的抑制涉及肝癌的恶性进展，TGF－β在HCC发生中起重要作用。     

钩藤酸E对人肝癌HepG2细胞的抑制作用及其机制研究

目的:通过体外实验研究钩藤酸E(UAE)抑制人肝癌细胞HepG2的细胞增殖作用,并进一步研究其作用机制.方法:MTT法考察钩藤酸E对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用,通过电镜观察细胞微细结构变化,流式细胞术进一步验证细胞凋亡,并检测细胞周期变化.结果:研究发现UAE能抑制HepG2细胞增殖.电镜分析证实UAE引起细胞凋亡.流式细胞术检测细胞凋亡主要发生于G0/G1期.结论:钩藤酸E诱导人肝癌细胞HepG2的细胞增殖,诱导其发生凋亡.     

去甲斑蝥素对人肝癌HepG2细胞生长抑制作用的实验观察

目的探讨去甲斑蝥素对人肝癌HepG2细胞系抑制和诱导凋亡作用。方法采用MTT法检测细胞的生长活性,应用流式细胞仪检测、透射电镜下观察去甲斑素处理HepG2细胞后细胞周期阻滞和细胞凋亡的发生情况。结果 5～40μg/ml去甲斑蝥素均能抑制HepG2细胞增殖(P<0.05),其抑制率与作用时间及NCTD浓度相关。流式细胞仪检测发现,去甲斑蝥素处理HepG2细胞后,实验组G2/M细胞明显多于对照组,P<0.05,提示细胞周期停滞于G2/M期。透射电镜下可见,HepG2细胞出现凋亡形态学改变。结论去甲斑蝥素对HepG2细胞有抑制作用,可能与阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡有关。     

STAT5A基因有效siRNA序列的筛选及其对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响北大核心CSCD

目的筛选针对STAT5A基因有效的siRNA,研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨STAT5A基因在肝癌发生发展中的作用。方法设计并化学合成针对STAT5A基因三个靶点的siRNA,采用脂质体法转染人肝癌细胞HepG2,分别用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染后HepG2细胞STAT5A mRNA和蛋白表达的变化,从中筛选出一段干扰效率最显著的siRNA;用该siRNA转染HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果三段STAT5A基因的siRNA均对HepG2细胞中STAT5A mRNA和蛋白表达产生了不同程度的抑制作用,其中以siRNA-3697的干扰效率最高,STAT5A mRNA和蛋白的表达抑制率分别为72.03%和66.27%(P<0.05);转染后1～4 d细胞生长速度减慢、增殖显著抑制(P<0.05);转染后48 h细胞凋亡率为37.33%(P<0.05)。结论成功筛选出针对STAT5A基因有效的siRNA;该siRNA可特异地阻断HepG2细胞STAT5A基因的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡。     

lncRNA PTPRG-AS1通过靶向miR-124-3p调控肝癌细胞凋亡和放射敏感性的研究机制

目的:探讨lncRNA PTPRG-AS1对肝癌细胞凋亡和放射敏感性的影响及作用机制。方法:培养正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402,qRT-PCR检测细胞中PTPRG-AS1和miR-124-3p表达水平。转染si-PTPRG-AS1、miR-124-3p mimics至HepG2细胞,抑制HepG2细胞中PTPRG-AS1表达或过表达miR-124-3p,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞放射敏感性,Western Blot法检测Bcl-2和Bax蛋白表达。生物信息学软件预测PTPRG-AS1与miR-124-3p存在互补的核苷酸序列,双荧光素酶报告基因实验验证PTPRG-AS1与miR-124-3p之间的调控关系。结果:与正常肝细胞L02相比,肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402中PTPRG-AS1表达显著升高（P＜0.05）,miR-124-3p表达显著降低（P＜0.05）。抑制PTPRG-AS1或过表达miR-124-3p均可促进肝癌HepG2细胞的凋亡,增强肝癌HepG2细胞的放射敏感性,抑制Bcl-2蛋白表达,促进Bax蛋白表达。PTPRG-AS1负调控miR-124-3p表达。抑制miR-124-3p表达可部分逆转抑制PTPRG-AS1表达对肝癌HepG2细胞凋亡的促进作用以及放射敏感性的增强作用。结论:抑制PTPRG-AS1表达可能通过上调miR-124-3p表达促进肝癌细胞的凋亡并提高其放射敏感性,是肝癌治疗的潜在作用靶点。     

自噬的抑制影响长春新碱诱导的肝癌细胞自噬性凋亡

目的研究自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine,3MA)对长春新碱(vincristine,VCR)诱导的肝癌细胞系HepG2细胞自噬性凋亡的影响.方法利用已建立的VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡之模型,采用monodansylcadaverin (MDC)染色及流式细胞术荧光强度测定方法对自噬进行定量研究,采用流式细胞术及DNA电泳检测细胞凋亡.结果 3MA可以特异性地阻止自噬泡形成,还可以部分地抑制HepG2细胞自噬性凋亡.结论自噬是VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡所必需的.     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性。方法用浓度为50 μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI 双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况。RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mRNA 和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性（P＜0.05）。结论5-Aza-CdR 可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性.方法 用浓度为50 μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况.RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mRNA和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性(P＜0.05).结论 5-Aza-CdR可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达.     

Brivanib 对 HepG2细胞的抑制作用及机制

目的：探讨 Brivanib 对人 HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用及其机制。方法：MTS 法检测 Brivanib 对HepG2细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测不同浓度 Brivanib 处理后 HepG2细胞的凋亡率,Western blot 检测凋亡相关蛋白 Bcl -2、Bax 的表达情况,免疫荧光观察 Brivanib 处理后 HepG2细胞内源性 LC3表达情况, Western blot 检测自噬关键蛋白 LC - I 向 LC - II 的转换及 p62的表达。结果：与空白对照组相比,Brivanib 对HepG2肝癌细胞的增殖抑制率随剂量增加和时间延长而增加,呈剂量和时间依赖性。不同浓度 Brivanib 作用72h 后 HepG2细胞的凋亡率分别为（13.06±4.06）%、（20.89±1.83）%、（44.29±2.56）%,其诱导凋亡与下调 Bax、上调 Bcl -2表达相关。2.5μmol/ L Brivanib 处理 HepG2细胞48h 后内源性 LC3表达增加。Western blot 分析表明,LC3- I 向 LC3- II 转换增加,p62表达降低。结论：Brivanib 抑制 HepG2人肝癌细胞增殖,诱导凋亡和自噬活化。     

缺氧对人肝癌HepG2细胞凋亡及p38MAPK通路的影响

目的:探讨缺氧对人肝癌HepG2细胞凋亡及p38MAPK通路的影响。方法:用三气培养箱培养肝癌细胞HepG2,建立缺氧细胞模型,CCK-8 法检测HepG2细胞的增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Real-time PCR分析p38MAPK mＲNA的表达,Western blot法检测p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达变化。结果:缺氧可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,抑制细胞凋亡（P<0.05）;缺氧处理人肝癌HepG2细胞后,p38MAPK mＲNA的表达量下调(P<0.05);Western blot结果显示缺氧可下调p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达（P<0.05）。结论:缺氧通过抑制p38MAPK通路抑制人肝癌HepG2细胞凋亡。     

白藜芦醇通过自噬途径对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

摘 要：［目的］ 研究白藜芦醇（Resveratrol,Res）对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡效应,并从自噬角度探讨其机制。［方法］ 不同浓度Res及联合自噬抑制剂3-MA处理HepG2细胞。CCK-8法检测各组的细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;MDC染色后荧光显微镜下观察自噬形态;RT-PCR和Western blot检测Beclin1、Bcl-2 mRNA及蛋白表达。［结果］ Res可以显著降低HepG2细胞的存活率和诱导凋亡。Res诱导HepG2细胞发生自噬,Beclin1表达显著上调,Bcl-2表达显著下调;联合3-MA抑制自噬后,减弱了Res对HepG2细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。［结论］ Res可通过诱导HepG2细胞自噬发挥抑制增殖和促凋亡作用,其机制可能与作用于Beclin1/Bcl-2复合体有关。     

氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制。方法:CCK-8法检测人肝癌HepG2细胞的增殖情况。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。Western blot检测ERK及P-ERK蛋白的表达水平。结果:氨基葡萄糖可以抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,且该作用随着药物浓度的增加而逐渐增强。1.0mmol/L氨基葡萄糖作用72h可以使G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低。同时,2.0mmol/L及4.0mmol/L氨基葡萄糖处理72h可以使人肝癌HepG2细胞发生凋亡。另外,随着药物浓度的增加,人肝癌HepG2细胞中ERK蛋白的磷酸化水平逐渐降低。结论:氨基葡萄糖可能是通过降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平影响细胞周期,从而抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。