烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

抗PVY云烟87定向改良新品种“云烟301”的选育及特征特性

抗PVY云烟87新品种“云烟301”是云南省烟草农业科学研究院、国家烟草基因工程中心在克隆烟草隐性抗PVY基因eif4e1（又称为感PVY基因eIF4E1）、开发功能性分子标记、分析国内外抗PVY品种和种质资源基因型过程中,以云烟87为母本、Y85×RY2/F₂为父本（携带eif4e1）杂交,以定向改良云烟87的PVY抗性为主要目标,通过连续回交、分子标记辅助选择、全基因组基因芯片背景检测等技术培育而成（非转基因）。云烟301的遗传背景恢复为云烟87的比率为99.43%,云烟301的PVY抗性显著提高,保留了云烟87的栽培烘烤特性、原烟风格特征和感官质量。在打顶后PVY发病率达到1%的云烟87种植区,种植云烟301可挽回病害损失,具有良好的推广价值。      

烟草PVY隐性抗病基因的分子标记及其适用性

马铃薯Y 病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草的重要病害, 种植抗病品种是经济有效的防治措施。分子标记辅助选择可提高抗病育种效率。来源于X-射线诱变的Virgin A Mutante(VAM) 的隐性抗PVY 基因位点(va)被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va 位点的育种利用效率, 根据烟草隐性抗PVY 基因(感病基因)eIF4E-1 基因序列, 设计特异扩增的引物CF2GR11,开发eIF4E-1 基因的分子标记, 并检测了该标记与抗性的遗传距离和在常见烟草资源中的适用性。CF2GR11 在云烟87、红花大金元和K326 等感PVY 品种可扩增出500 bp 产物, 在NC102、NC55 和K326PVY 等抗病品种无扩增条带。以抗、感PVY 亲本构建的101 个F₂ 单株为定位群体, 遗传连锁分析表明, CF2GR11 标记与烟草PVY 感病基因的遗传距离为0.99 cM。对46 份PVY 抗性明确的栽培烟草资源的检测表明, 供试资源的标记检测结果与抗性的吻合度为100%, 表明CF2GR11 标记适用性高。该目的基因标记可用于抗PVY 育种的辅助选择和抗PVY 资源的鉴定。      

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。      

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

晒烟品种塘蓬烟抗白粉病基因的等位性测定和序列分析

  背景和目的  广东连江县晒烟品种"塘蓬烟"是我国特有的烟草隐性遗传白粉病抗性种质资源,但到目前为止对其抗病机制未见深入报道。  方法  利用塘蓬烟花粉与抗白粉病烟草品种Kutsaga E1及感病品种K326杂交进行抗病基因的等位性检测;利用等位基因分子标记检测塘蓬烟中感白粉病基因NtMLO1/2的突变情况;利用PCR克隆技术获得塘蓬烟NtMLO1/2基因的cDNA和gDNA序列信息,明确基因突变类型。  结果  （1）根据等位性测验结果推断塘蓬烟白粉病抗性由NtMLO1/2隐性突变基因控制。（2）等位基因分子标记检测和PCR克隆测序结果发现塘蓬烟NtMLO2基因的转录本发生外显子重复突变,形成一个新的可变剪接变异体。  结论  本研究从分子水平阐述了地方烟草品种塘蓬烟的抗白粉病机制,其结果不仅丰富了烟草抗白粉病基因资源信息,而且为日后抗性基因资源的深入研究和合理利用提供了参考依据。      

烟草祖先种及重要野生种PDR1基因的生物信息学分析

植物的多向耐药性（Pleiotropic drug resistance, PDR）转运蛋白隶属于ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族的G亚家族。该类蛋白参与植物多种初生、次生代谢物的跨膜运输,在植物的生长发育、响应逆境胁迫、解毒过程中起着重要作用。近年的研究还表明,该蛋白与多种植物对真菌病原的抗性有关。本文以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥PDR12蛋白、烟草的PDR1基因为探针,通过搜索同源序列,从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的PDR基因、蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构、功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以本氏烟（Nicotiana benthamiana）NbPDR1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以普通烟草（Nicotiana tabacum）NtPDR1基因为例,预测了其基因编辑位点。结果表明,这些PDR基因相似性高,均编码跨膜蛋白,具有典型的跨膜结构域和核酸结合结构域。该基因启动子区有多个与病原真菌诱导、干旱等逆境胁迫响应相关的元件,暗示该基因可能是抗真菌病害、响应逆境胁迫的广谱抗性基因。最后,本文预测的基因编辑位点,为烟草PDR基因的功能研究、基因编辑及抗病育种提供理论基础。      

烟草抗PVY的EMS突变体pvyr1筛选与抗性遗传初步分析

为了从烟草EMS突变体库中筛选抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)突变体,采用苗期人工接种初筛M2抗病单株,对M3、M4和M5株系连续接种鉴定PVY抗性。采用e IF4E1基因特异分子标记检测和c DNA全长测序,分析突变体PVY抗性是否与e IF4E1突变有关。配制F1群体初步分析抗性遗传特性。苗期人工接种从1800份M2种子中筛选到1份抗PVY的烤烟突变体。冬季无加温措施塑料大棚内苗期人工接种PVY坏死株系MN分离物,接种后35 d未诱变对照品种发病率为100%,E9119-1Z/M3株系的发病率为56.3%,无症状单株ELISA检测PVY均为阴性,表明E9119-1Z/M3株系对PVY中抗。E9119-1Z的M4株系和M5株系在光照培养室内苗期人工接种对PVY坏死株系MN分离物和ZT-5分离物表现为中抗。E9119-1Z-R14-2/M5株系为抗性稳定的突变体,命名为pvyr1。pvyr1采用e IF4E1基因特异分子标记检测为阳性,c DNA测序表明e IF4E1基因无突变。pvyr1与未诱变对照品种(感PVY)、va位点抗PVY品种NC55的杂交F1代抗性鉴定结果初步表明,pvyr1突变体对PVY的抗性符合孟德尔隐性遗传,且与NC55的va位点不等位。表明pvyr1为一个与e IF4E1基因突变不同的抗PVY新资源。     

PVY抗性基因eif4E-pvr2转化烟草的初步研究

eif4E-pvr2基因是辣椒中的一种PVY抗性基因,与感病辣椒品种的eif4E基因只有两个碱基的差异.实验采用RT-PCR从感病材料中克隆得到感病的eif4E基因,再经过定点突变得到eif4E-pvr2基因,构建了抗性表达载体pMEIF2301,并利用叶盘法转化烟草,经GUS和PCR检测,初步明确eif4E-pvr2基因已整合到烟草基因组中.     

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

五个烟草野火菌株的生理小种鉴定

  背景和目的  针对目前国内尚未以国际通行的抗性鉴别宿主区分烟草野火菌的生理小种, 首次基于抗性遗传规律鉴定了所收集野火菌株的生理小种归属。  方法  通过大田喷雾接种、温室浓度梯度接种、无损伤接种及同一叶片上的对比试验等4个平行试验, 将ATCC11528等5个野火菌株接种到黄花烟等6个不同抗源遗传背景的烟草上, 根据不同试验出现的不同病理反应对各野火菌株进行生理小种分类。  结果  所收集的5个野火菌株经多轮分子标签鉴定纯化, 可用于接种试验。野火菌株D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分别被鉴定为0、1、3等3个小种。  结论  采用国际通行的抗性鉴别宿主和4个平行接种试验区分了5个野火菌株的生理小种归属。为培育野火菌小种专化抗病烟草和克隆烟草中小种专化抗病基因提供了重要基础。      

抗TMV普通烟中N导入片段的特异分子标记开发与交换单株筛选

  背景和目的  N导入片段赋予烟草品种对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）抗性,但同时带来产量低等连锁累赘,为了筛选减少连锁累赘的交换单株。  方法  以普通烟草中的N导入片段为材料,利用茄科作物基因组序列数据和比较基因组学方法,开发了特异扩增N导入片段的系列分子标记,通过分子标记在种质资源和分离群体中筛选交换单株。  结果  开发出23个N导入片段特异的分子标记,将携带N导入片段的普通烟种质划分为Coker176、Samsun NN和Xanthi nc三种长度类型。供试90份抗TMV的普通烟资源中,85份属于N导入片段长度相对较短的Coker176类型,未发现比Coker176更短的种质资源。利用N导入片段末端分子标记TN5.51,从不含N基因的K326、Y87、5F、HD与Coker176配置的4个回交分离群体的22572株抗TMV单株中,筛选到11株N导入片段交换单株,Coker176类型的N导入片段在普通烟中的交换频率为0.049%。其中24-8H等3个单株的N导入片段缩短约一半,具有减少连锁累赘的潜力。  结论  本研究获得了普通烟中N导入片段的系列分子标记和长度缩短一半的交换单株,为解析N导入片段连锁累赘的分子机理、减少连锁累赘奠定了基础。      

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。      

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

  目的  探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。  方法  以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。  结果  （1）共获得6株T₀代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T₁代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T₁代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。  结论  定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。      

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。