乙醇胁迫对乳酸杆菌关键酶活力的影响

分别以面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum D2-5)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum D5-5)为研究对象,进行不同乙醇体积分数胁迫后菌体活力的对比,测定了乙醇胁迫后菌体中己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)及ATP酶的活力变化,分析了乙醇胁迫后造成菌体失活的主要因素。结果表明:5%乙醇胁迫处理有助于提高菌体存活率,但是效果不显著;8%乙醇胁迫后的菌体存活率明显降低,面包乳杆菌D2-5和植物乳杆菌D5-5存活率依次仅为26.61%和23.50%,菌体的生长受到严重抑制,致使相关酶活力降低。乙醇胁迫对乳酸杆菌己糖激酶影响不显著,对其丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及ATP酶具有极显著的影响。这一结果说明,丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及ATP酶是影响乙醇胁迫损失的关键酶,酶活力变化与菌体活力相关。     

乙醇胁迫对植物乳杆菌膜生理及黏附性的影响

目的：探讨植物乳杆菌在乙醇胁迫下黏附性变化及其抗乙醇胁迫的生理响应机制。方法：用不同体积分数的乙醇胁迫植物乳杆菌,测定菌体存活率、细胞膜完整性及超微结构的变化;采用人体结肠癌细胞HT-29作为体外黏附模型,测定乙醇胁迫后菌体对HT-29细胞的黏附率;通过气相色谱-串联质谱法分析菌体细胞膜脂肪酸的变化。结果：随着乙醇体积分数的增加,植物乳杆菌的存活率逐渐下降,菌体细胞膜完整性及其表面结构遭到破坏,对HT-29细胞黏附率降低,同时,细胞膜中脂肪酸的不饱和脂肪酸比例升高。结论：乙醇胁迫可降低菌体黏附HT-29细胞的能力,植物乳杆菌细胞膜中脂肪酸的组成及其完整性在抗乙醇胁迫过程中发挥重要作用。     

植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖的工艺优化

以乳糖为底物,利用含β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖(GOS).在5L发酵罐上进行了以乳糖为碳源的植物乳杆菌WZ011的厌氧培养,β-半乳糖苷酶产量在发酵14 h时达到最大值5 U/mL.收获的植物乳杆菌菌体用于透性化全细胞催化生产GOS的研究.比较了乙醇、Tween 80、SDS、DMSO、丙酮这五种渗透剂对胞内β-半乳糖苷酶酶活的影响.结果表明以40％乙醇作为渗透剂处理最为有效,β-半乳糖苷酶胞内酶活可达500 U/g(细胞干重DCW).进一步对40％乙醇渗透处理后整细胞催化生产GOS的工艺条件进行了研究,结果表明乳糖浓度、初始pH、温度和反应时间对GOS合成均有显著影响.在乳糖质量浓度为400g/L,初始pH为7.0,温度50℃及反应进行10h的条件下,GOS产量达到最大值32％(质量分数).     

抗生素环丙沙星胁迫植物乳杆菌ZLC-18应激反应的研究

本研究采用0.1、0.5、2.0 μg/mL的环丙沙星作为实验药物,通过研究环丙沙星主动胁迫下肠道内植物乳杆菌产生的应激反应,为开发一类具有抵御抗生素胁迫能力、保持肠道菌群微生态平衡的益生菌制剂提供理论依据。结果表明,环丙沙星胁迫下,植物乳杆菌菌体存活率整体呈下降趋势,且菌体存活率随环丙沙星浓度增大而降低;观察菌体细胞膜完整性发现,细胞膜受损程度与环丙沙星浓度呈正相关;测定菌体侧向扩散速率来反映其细胞膜流动性,结果显示,2.0 μg/mL的环丙沙星会使菌体细胞膜流动性极显著降低(P<0.01),与对照组相比降低了39.93%;菌体超微结构观察发现,环丙沙星会明显改变植物乳杆菌的菌体形态,严重时可造成细胞质外泄,甚至导致细胞死亡;菌体糖代谢关键酶活力结果表明,2.0 μg/mL环丙沙星处理后的己糖激酶、丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶酶活力均极显著下降(P<0.01),而经0.5 μg/mL环丙沙星胁迫后,与对照组乳酸脱氢酶酶活(0.069±0.002)U/mg prot相比,其乳酸脱氢酶活力反而增加,酶活为(0.081±0.006)U/mg prot(P<0.01);反复用质量浓度为0.5 μg/mL的环丙沙星胁迫菌体后,其乳酸脱氢酶酶活为(0.126±0.004)U/mg prot(P<0.01)。说明在低浓度环丙沙星的胁迫下,植物乳杆菌会产生应激胁迫响应,启动自我保护机制,抵御抗生素不良胁迫,这为肠道益生菌制剂开发提供了重要的技术支撑。     

高产胞外多糖嗜热链球菌混菌培养特性研究

探讨高产胞外多糖嗜热链球菌混菌培养的产酸、产香、产黏特性。以发酵酸度、乙醛质量浓度和黏度为综合指标,确定高产胞外多糖的嗜热链球菌(S.t.)、保加利亚乳杆菌(L.b.)、嗜酸乳杆菌(L.a.)混菌最佳培养条件为培养温度42℃,总接菌量体积分数4%,V(S.t.):V(L.b.):V(L.a.)=3:2:1。在此条件下,混菌培养可以显著地提高酸度、乙醛质量浓度、黏度、胞外多糖质量浓度、β-半乳糖苷酶酶活、蛋白酶水解能力(P<0.01)。发酵过程中,胞外多糖质量浓度与黏度,β-半乳糖苷酶酶活与酸度,蛋白酶酶活与酸度、乙醛质量浓度的相关性系数很高。     

耐受乙醇乳酸菌诱变的研究

以面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum D2-5）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum D5-5）为研究对象,分别选取不同浓度乙醇胁迫处理后,进行诱变育种,探究经乙醇胁迫后乳酸菌诱变育种的耐受性;根据最佳诱变剂量的条件,确定最佳诱变方法;以乙醇胁迫处理后乳酸杆菌的生长曲线,验证乙醇胁迫后乳酸菌诱变菌株的耐受性。结果表明：添加与乳酸菌悬浮液等体积的1%硫酸二乙酯（DES）化学诱变效果最佳,最适诱变时间为40 min,乙醇胁迫过程中诱变菌株的生长速率有所提高,以体积分数8%乙醇胁迫为例,24 h时,D2-5菌落总数的对数值由6.2提高至7.3,D5-5菌落总数的对数值由6.9提高至7.1。说明诱变育种有助于乳酸杆菌乙醇胁迫耐受性的提高,并获得乙醇耐受特性较好的菌株D2-5。     

油酸对植物乳杆菌LIP-1生长及冻干存活率的影响及其机理

以植物乳杆菌LIP-1为研究对象,在培养基中添加不同质量浓度油酸(C18:1ω9c),研究C18:1ω9c对该菌株生长及冻干存活率的影响。结果表明:在MRS培养基中添加低质量浓度(≤0.2 g/L)C18:1ω9c可提高活菌数和冻干存活率,C18:1ω9c最适添加质量浓度为0.1 g/L,在此质量浓度下,与未添加C18:1ω9c的空白对照组相比,活菌数提高了9×108 CFU/mL,冻干存活率提高了8.38%;当培养基中C18:1ω9c质量浓度≥0.3 g/L时,菌株的生长受到抑制。用气相色谱法分析细胞膜脂肪酸构成,结果显示,与空白对照组相比,0.1 g/L组不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值提高了0.45%,环丙烷脂肪酸(C19cyc11)比例上升了8.35%;相关性分析表明,棕榈酸与C19cyc11之间呈显著负相关,硬脂酸与C18:1ω9c呈显著负相关;荧光显微镜下观察植物乳杆菌LIP-1冻干菌体,实验组发出绿色荧光的菌体明显多于对照组,这说明在冷冻干燥过程中实验组细胞膜完整性维持得较好;测定冻干后植物乳杆菌LIP-1上清液中β-半乳糖苷酶的活性,发现实验组上清液中酶活性低于MRS组,表明低质量浓度C18:1ω9c(≤0.2 g/L)能维持细胞膜的完整性,降低β-半乳糖苷酶的泄漏量。结论:培养基中添加低质量浓度C18:1ω9c能促进菌体合成C19cyc11,诱导饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸,提高菌株对冷冻干燥的抗性。     

不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响

在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵产转糖基β-半乳糖苷酶过程中,以单因素试验为基础研究了不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响,利用Mintab15软件响应面分析法优化在转糖基β-半乳糖苷酶活性最大时的最佳金属离子浓度、表面活性剂的添加量及加入时机。结果表明,发酵培养基中镁离子浓度为0.031%,吐温-80添加量为0.24%,钾离子浓度为0.047%时,最有利于提高转糖基β-半乳糖苷酶的活性且酶的活性最大。为保持产酶过程中β-半乳糖苷酶的最大活性,在菌体生长对数期的初期,OD值为1.6时添加0.2%的吐温-80,添加过早或过晚都会影响转糖基β-半乳糖苷酶的活性。     

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作为食品级筛选标记的研究

为研究嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)作为食品级筛选标记的活性及筛选稳定性,作者从嗜酸乳杆菌基因组中克隆β-半乳糖苷酶基因并在乳酸乳球菌中表达,通过X-gal显色筛选阳性克隆;用X-gal显色筛选方法将重组乳酸乳球菌传60代,并测定β-半乳糖苷酶酶活和比活力。结果显示:通过表达有活性的β-半乳糖苷酶和X-gal显色可成功筛选出阳性克隆菌株;对借助X-gal传60代后的重组乳酸乳球菌进行β-半乳糖苷酶比活力检测,与X-gal筛选的第二代相比没有显著差异(P=0.5920.05),与红霉素筛选比较也没有显著差异(P=0.8820.05)。由此可见,β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性,为以β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记的食品级载体的研究奠定了基础。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

双波长比值光谱法测定5＇-鸟苷酸钠、5＇-肌苷酸钠、5＇-尿苷酸钠含量

依据5＇-鸟苷酸钠、5＇-肌苷酸钠和5＇-尿苷酸钠三组分的比值光谱特征,以尿苷酸钠为干扰组分时,选择258、285、244、280nm作为测定鸟苷酸钠和肌苷酸钠的波长;以肌苷酸钠为干扰组分时,选择211、241nm作为测定尿苷酸钠的波长。结果显示鸟苷酸钠在0.15～5mg/100ml,肌苷酸钠在0.2～6mg/100ml,尿苷酸钠在0.25～4mg/100ml范围具有良好的线性关系,平均回收率分别为100.2%、100.2%和99.5%。本法具有测定波长少、计算简单、光谱＂分离＂能力强以及能在低档分光光度计上实现、易于推广等特点。     

双波长比值光谱法测定5''-鸟苷酸钠、5''-肌苷酸钠、5''-尿苷酸钠含量

依据5'-鸟苷酸钠、5'-肌苷酸钠和5'-尿苷酸钠三组分的比值光谱特征,以尿苷酸钠为干扰组分时,选择258、285、244、280nm作为测定鸟苷酸钠和肌苷酸钠的波长;以肌苷酸钠为干扰组分时,选择211、241nm作为测定尿苷酸钠的波长.结果显示鸟苷酸钠在0.15～5mg/100ml,肌苷酸钠在0.2～6 mg/100ml,尿苷酸钠在0.25～4mg/100ml范围具有良好的线性关系,平均回收率分别为100.2%、100.2%和99.5%.本法具有测定波长少、计算简单、光谱"分离"能力强以及能在低档分光光度计上实现、易于推广等特点.     

高效液相法测定调味品中5''''-鸟苷酸二钠和5''''-肌苷酸二钠

采用Inertsil ODS-3色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);以0.02moL/L磷酸二氢钾溶液(pH4.5)为流动相,流速1.0mL/min,柱温25℃,检测波长250nm,同时分离了样品中5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠.结果显示:在选定色谱条件下5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠线性关系良好,加样平均回收率为98.6%～100.3%;相对标准偏差0.77%～1.67%.该方法精密度好,结果准确可靠,适合于调味品中5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠的定量分析.     

高效液相法测定调味品中5’-鸟苷酸二钠和5’-肌苷酸二钠

采用Inertsil ODS-3色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);以0.02moL/L磷酸二氢钾溶液(pH4.5)为流动相,流速1.0mL/min,柱温25℃,检测波长250nm,同时分离了样品中5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠。结果显示:在选定色谱条件下5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠线性关系良好,加样平均回收率为98.6%～100.3%;相对标准偏差0.77%～1.67%。该方法精密度好,结果准确可靠,适合于调味品中5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠的定量分析。