水牛乳中蛋白质基于RP-HPLC指纹图谱的建立及在乳源分析中的应用

以水牛的乳蛋白多态性规律,κ-CN/A、α_(s2)-CN、κ-CN/B、α_(s1)-CN、β-CN、β-LgB、α-La在液相色谱中的分离特征和峰面积作为评价指标,对不同来源的水牛乳和荷斯坦牛乳建立指纹图谱快速区分鉴别水牛乳掺假。选择ZORBAX 300SB-C8(4.6 mm×150 mm,3.5μm)色谱柱;检测波长为215 nm;柱温:45℃;流速:0.5 mL/min;流动相:0.1%TFA水溶液:0.1%TFA乙腈进行梯度洗脱。结果:在精密度、重复性和稳定性实验中,分离出的κ-CN/A、α_(s2)-CN、κ-CN/B、α_(s1)-CN、β-CN、β-LgB、α-La峰面积相对标准偏差(RSD%)5%;根据水牛与荷斯坦蛋白多态性的差异,对乳蛋白进行分离后建立指纹图谱,通过相似性计算水牛乳和荷斯坦牛乳样品间的相似性均大于0.95,相关性高。通过指纹图谱对比发现特征峰,作为掺假标记,当荷斯坦牛乳掺入2%时可被检测到,在掺入5%～40%荷斯坦牛乳的范围内,相关系数大于0.99。该方法具有良好的重现性和专属性,能够得到样品间具有代表性的指纹图谱,能快速稳定地分析水牛乳中是否掺入荷斯坦奶源。     

高效液相色谱法测定β-酪啡肽

以SinoChrom 300A C8柱为分离柱,对高效液相色谱法测β-酪啡肽进行了研究.结果表明,以水(内含体积分数为0.1%TFA)和体积分数95%乙腈(内含体积分数为0.1%TFA)分别为流动A相和B相,在梯度洗脱流速1.0 mL/min,检测波长215 nm条件下,β-酪啡肽-5和β-酪啡肽-7被有效分离且具有较大的响应值,峰面积和保留时间具有良好的稳定性.同时在β-酪啡肽-5和β-酪啡肽-7质量浓度分别为1.0 g/L和1.2 g/L时,进样体积与峰面积呈良好的线性关系(回归系数r分别为0.9950和0.9955).该法可快速准确分离分β-酪啡肽.     

一种利用毛细管电泳间接测定生鲜乳中添加大豆分离蛋白的方法

运用高效区带毛细管电泳法以pH2.7浓度配制为15mmol/L柠檬酸-20mmol/L柠檬酸三钠作电泳缓冲液同时测定了生鲜乳蛋白和大豆分离蛋白。结果显示β-CN峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为3.01%和0.62%,κ-CN峰面积和迁移时间的RSD分别为2.03%和0.49%,大豆分离蛋白峰面积和迁移时间的RSD分别小于5.12%和0.48%,均满足定性和定量分析的要求。建立了利用蛋白峰面积比例关系间接测定生鲜乳中大豆分离蛋白的分析方法,其中β-CN和κ-CN检测限分别为0.17mg/L和0.23mg/L,回收率为99.37%和99.23%,大豆分离蛋白检测限和回收率分别为5.73mg/L和87.44%.     

反向高效液相色谱法分离检测乳粉中的酪蛋白

以C8色谱柱为分离柱,利用反相高效液相色谱法,在流速1.0 mL/min,检测波长220 nm,柱温25℃,0.1%TFA水溶液为A流动相;100%乙腈溶液为B流动相的梯度洗脱条件下对乳粉中酪蛋白的4种组分(α_(S1)-酪蛋白、α_(S2)-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)分离检测。结果表明,该法具有良好的线性关系,重复性好,加标回收率高,对全脂牛乳粉、羊乳粉等乳粉中酪蛋白组分的分离测定有很好的效果。     

钛胶正相高效液相色谱法同时分析三聚氰胺和三聚氰酸

建立了同时分析液态奶、自来水和游泳池水中三聚氰胺和三聚氰酸的钛胶正相高效液相色谱法。色谱条件:分离柱为Titania Sachtopore-NP柱(250mm×4.6mm×5μm),流动相为水∶甲醇=50∶50(V/V)、流动相中含醋酸盐1.0mmol/L、pH7.0、流速0.8mL/min、柱温60℃、UV检测波长210nm。三聚氰胺和三聚氰酸分别在0.1～10μg/mL和2～100μg/mL范围内与对应的峰面积呈良好的线性关系,检出限分别为0.02μg/mL和0.1μg/mL,本方法三聚氰胺的回收率为94.8%～111.7%,三聚氰酸回收率为103.9%～114.3%,三聚氰胺和三聚氰酸测定结果的相对标准偏差分别为0.62%和0.78%(n=8)。     

高效液相色谱分析乳清蛋白方法研究

建立测定乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的高效液相色谱分析方法,采用Agilent的ZORBOX Eclipse XDB-C8色谱柱(150 mm×4.6 mm),流动相A为10%乙腈中含0.1%三氟乙酸,流动相B为90%乙腈中含0.1%三氟乙酸。采用梯度洗脱,流速为0.25 mL/min,二极管阵列检测器,检测波长214 nm,柱温40℃。外标法定量,α-La和β-Lg两种组分线性关系良好,相关系数分别为0.993 1和0.990 9,检测限为3μg/mL、8μg/mL。     

HPLC-ELSD法定量分析红曲霉发酵样品中的γ-氨基丁酸

采用蒸发光散射检测器(ELSD)对红曲霉发酵样品中的γ-氨基丁酸(GABA)进行HPLC分析。色谱柱为Shim-packVP-ODSC18(4.6×150mm;5μm)柱,流动相:A为0.1%TFA水溶液,B为0.1%TFA乙腈溶液,流速为0.6ml/min,进行梯度洗脱,检测器为AlltechELSD2000,漂移管温度95℃,气体流量2.5SLPM。结果表明:log穴峰面积雪-log穴GABA浓度雪的标准曲线在10.0～120.0μg/ml范围内线性关系良好,r=0.9972。该方法的回收率为98.87%,相对标准误差(RSD)为0.50%。本方法操作简便、准确、可靠。     

反相高效液相色谱法检测大豆蛋白外啡肽的研究

大豆蛋白序列中隐藏着外啡肽β-酪啡肽-3(β-CM-3)的片段,使得大豆肽食品中含有外啡肽β-CM-3成为可能,因此有必要对大豆肽食品进行外啡肽β-CM-3定性和定量的检测。采用反相液相色谱的方法,以β-酪啡肽-3标准品进行了包括分离柱、流动相的选择、柱温、柱压、流速、检测波长和灵敏度等色谱条件的探索,得出检测条件为波长220nm,柱温25℃,进样量10μL,采用等度洗脱,洗脱条件为:含0·1%TFA的14%乙腈溶液。流速0·9mL/min,洗脱时间为60min。该方法的相对标准偏差为4·07%,平均回收率为95·3%,最小检测浓度为0·4μg/mL。对照标准品保留时间和峰面积,得出酸性蛋白酶/Alcalase=4h/2h酶解液中含有目标外啡肽156·41μg/g。     

两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量检测研究

分别以兔血清IgG与鸡卵黄抗体(IgY)为检测抗体,建立了两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量方法。牛乳κ-酪蛋白分别免疫新西兰大白兔和临产母鸡,经亲和层析分离纯化后得到anti-κ-CN-IgG与anti-κ-CN-IgY两种抗体。两种抗体均与β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳清粉存在一定交叉反应,抗体与相应抗原进行免疫吸收后得到高特异性IgG与IgY。用吸收后的anti-κ-CN-IgG建立的间接ELISA法,当标准κ-CN质量浓度在0.098~3.125 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度具有线性关系,变异系数小于1%,回收率在99.10%~101.1%之间;用吸收后的anti-κ-CN-IgY检测κ-CN,在0.098~6.25 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度成良好的线性关系,变异系数小于2%,回收率在98%~100.8%之间。当三聚氰胺掺假量在0~20%时,两种抗体均能通过κ-CN的定量检测而实现乳品的掺假检验。     

HPLC法测定牡丹籽油中游离型和结合型α-亚麻酸、亚油酸及油酸的含量

采用高效液相色谱(HPLC)法测定牡丹籽油中游离型、结合型α-亚麻酸、亚油酸及油酸的含量。检测条件为Agilent C18高效色谱柱(3.0 mm×50 mm,2.7μm),流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(体积比85∶15),流速1 mL/min,检测波长203 nm,柱温35℃,进样量20μL。结果表明,该方法精密度、重复性、稳定性良好。α-亚麻酸在41.4~207μg/mL范围内,其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系;亚油酸在20.2~101μg/mL范围内,其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系;油酸在14.9~74.6μg/mL范围内,其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。牡丹籽油样品中,游离型α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均含量分别为4.47、1.89 mg/mL和0.92 mg/mL,结合型α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均含量分别为437、237 mg/mL和156 mg/mL。建立的方法具有分离效率高、选择性好和条件温和的优点。     

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中甲硝唑残留

目的 优化鸡蛋中甲硝唑残留的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(SPE-UPLC-MS/MS)分析检测方法。方法 样品经乙酸乙酯提取后,用MCX固相萃取小柱净化,以C18色谱柱进行分离,以0.1% 甲酸水-0.1% 甲酸甲醇溶液为流动相,梯度洗脱分离,在电喷雾ESI离子源正离子模式下,采用质谱多反应监测(MRM)模式进行定性分析,以内标法进行定量分析。结果 方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.02 μg/kg和0.2 μg/kg。精密度较好,在1.00 μg/L~100.00 μg/L范围内,甲硝唑的质量浓度和峰面积呈现出良好的线性关系,其相关系数为0.9996。结论 本方法简单,准确,可靠,能满足兽药残留分析的要求。     

HPLC梯度洗脱法测定DEPBT的纯度

目的建立HPLC法测定DEPBT纯度的方法。方法采用C18色谱柱(4.6 mm×25 cm,5μm);流动相A为0.1%TFA水溶液, B为0.1%TFA乙腈溶液,梯度洗脱:0～20 min,A:70%～0%;20～25 min,A:0%～0%;25～25.1min,A:0%～70%;25.1～35 min,A:70%～70%;流速1.0 ml/min,检测波长265nm。结果 DEPBT峰与各降解杂质峰,及各降解杂质峰间分离度均≥1.0。结论本法简便、灵敏、专属性好、结果稳定,可用于DEPBT纯度的测定。     

HPLC测定厄贝沙坦片有关物质

目的建立HPLC测定厄贝沙坦片有关物质含量的方法。方法采用Agilent Pursuit C18色谱柱(4.6mm×250 mm,10μm),以乙腈-0.025 mol/L KH2PO4溶液(35:65,用三乙胺调pH至6.0)为流动相,流速1.0m L/min,柱温30℃,检测波长220 nm;用外标法计算有关物质A的含量,以峰面积归一化法计算其他杂质的含量。结果主成分与有关物质A的分离度大于2.0,有关物质A的质量浓度与峰面积在0.1~0.6μg/m L范围内线性良好(r=0.9981);平均回收率为98.9%(n=9),RSD为2.1%。结论方法简便、快速、准确可靠,适用于厄贝沙坦片有关物质检查。     

镰刀霉菌(Fusarium sp)JN158色素提取和分离技术的研究

研究了镰刀霉菌(Fusarium sp)JN158色素的提取条件、溶解特性和液相分离方法,实验结果表明:该紫色素的最佳提取溶剂为纯乙酸;色素只能溶解于酸性的有机溶剂或有机酸中;色素的最佳液相分离条件是:色谱柱,Phecda C18(5μm,4.6 mm×250 mm);柱温:25℃;DAD检测器检测波长:254 nm;流量:1.0 mL/min,进样量:10μL,流动相A,0.1%TFA的乙腈(V:V),流动相B,0.1%TFA的蒸馏水(V∶V),梯度洗脱条件:流动相A,0~3 min,2%增到6%,3~3.1 min,6%增到45%,3.1~28 min,45%增到70%,28~32 min,70%增到80%;分离得到8种色素,在酸性乙腈中,1种呈现黄色,4种呈现红色,3种呈现橙色,按出峰顺序,8种色素的吸收峰分别为508、458、456、498、510、456、454、506 nm。     

青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氢酸的HPLC分析

建立了青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氨酸(BPA)过程中各成分的HPLC分析方法.用Zorbax XDB-C18柱在流动相为含35%(v/v)乙腈的7mmol/L pH 3.0磷酸缓冲液(含SDS 0.68g/L),流速为1.0mL/min,柱温30℃,检测波长为210nm等条件下,四种物质苯乙酰胺、BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸可以被有效分离,且在≤0.2mg/mL浓度下,四种物质含量与出峰面积均呈良好的线性相关.用Chirobiotic T和Chirobiotic R手性柱分别对手性物质N-苯乙酰-BPA和BPA的对映异构体进行了分离检测,并确定了最佳的洗脱条件.     

超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定尿液中的毒蕈碱

目的采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱建立固相萃取法快速分析尿液中毒蕈碱残留的检测方法。方法样品直接经固相萃取柱富集和净化,以HSS T_3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm)为分析柱,含0.1%甲酸的乙腈及含0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸铵的水溶液作为流动相A、B进行梯度洗脱分离,外标法定量。采用正离子采集模式对样品进行快速筛查,t MSMS采集模式定量分析。结果毒蕈碱在0.05~5μg/L范围内呈良好的线性关系,回归系数(r)大于0.999,该方法的检出限和定量限分别为0.02和0.05μg/L。以空白尿液样品进行0.05、0.1和0.5μg/L 3个水平的加标回收试验,毒蕈碱的平均回收率范围在73.2%~97.9%之间,RSD为2.5%~10.2%。结论本方法简单、灵敏、准确,适用于尿液中毒蕈碱残留的快速筛查和分析测定,可满足临床中毒分析和法医鉴定的检测需求。     

青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氨酸的HPLC分析

建立了青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氨酸(BPA)过程中各成分的HPLC分析方法。用ZorbaxXDB-C18柱在流动相为含35%(v/v)乙腈的7mmol/LpH3.0磷酸缓冲液(含SDS0.68g/L),流速为1.0mL/min,柱温30℃,检测波长为210nm等条件下,四种物质苯乙酰胺、BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸可以被有效分离,且在≤0.2mg/mL浓度下,四种物质含量与出峰面积均呈良好的线性相关。用ChirobioticT和ChirobioticR手性柱分别对手性物质N-苯乙酰-BPA和BPA的对映异构体进行了分离检测,并确定了最佳的洗脱条件。     

HPLC法同时测定植物油中维生素A和不同构型维生素E含量

以石油醚为溶剂,用索氏提取法提取了黑芝麻、白花生、黑花生、葵花籽、大豆、棉花籽的油脂。油样品先用正己烷溶解,然后用甲醇定容,其中正己烷含量为20%(v/v),用Hypersil ODS2 5μm色谱柱,甲醇为流动相,对所提油脂中维生素A、α-维生素E、γ-(β)维生素E、δ-维生素E含量进行检测。实验结果表明,在204nm波长下,维生素A、α-维生素E、γ-(β)维生素E、δ-维生素E在0~200μg/m L范围内与峰面积有良好的线性关系,标准曲线相关系数r均大于0.9978。维生素A、α-维生素E、γ-(β)维生素E、δ-维生素E加标平均回收率分别为97.83%、98.58%、98.75%、99.93%。     

高效液相色谱法测定乳清蛋白主要成分的研究

建立了测定乳清蛋白中α-La和β-Lg含量的高效液相色谱分析方法,采用Kromasil C8色谱柱(5μm,250mm×4.6mm),流动相A为0.1%的三氟乙酸-水溶液,流动相B为0.09%的三氟乙酸-乙腈溶液梯度洗脱,流速为0.8mL/min,二极管阵列检测器,检测波长215nm,柱温30℃。外标法定量,α-La和β-Lg两种组分线性关系良好,相关系数分别为0.9998和0.9984,检测限为3μg/mL、10μg/mL。     

生姜蛋白酶的凝乳作用及相关机理探讨

从生姜中分离得到具有凝乳活力的生姜蛋白酶,采用Urea SDS-PAGE、RP-HPLC和MALDI-TOF/MS等方法分析生姜蛋白酶对酪蛋白单体和脱脂乳中酪蛋白的水解作用。结果表明,生姜蛋白酶水解κ-酪蛋白生成的主要产物比较稳定,不会被进一步水解。温度高于60℃时生成κ-CN(f 1-90)和κ-CN(f 1-102)两个末端疏水性肽段,其次为κ-CN(f 1-121),温度较低时,还生成大量分子量高于κ-CN(f 1-121)的产物。在脱脂乳体系中,生姜蛋白酶水解脱脂乳的κ-酪蛋白,而对αS1-、αS2-和β-酪蛋白没有显著的水解作用。主要裂解κ-酪蛋白的Thr121-Ile122键,生成疏水性N末端肽段κ-CN(f 1-121)。这一结果表明生姜蛋白酶凝乳的主要机理是水解κ-酪蛋白Thr121-Ile122肽键,破坏了酪蛋白微粒的稳定性,促使酪蛋白形成凝胶。