肝癌组织CT抗原基因CSAG1表达及体外对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨CSAG1(chondrosar-coma associated gene 1)基因在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生长增殖的影响,为了解肝癌发生的分子机制奠定理论基础.方法:利用半定量RT-PCR技术检测CSAG1基因在12例肝癌和癌旁组织中的表达差异;RNA干扰技术沉默肝癌细胞株(Focus)内CSAG1基因的表达;利用CCK-8、克隆形成实验以及流式细胞仪分别定量分析内源性CSAG1基因被沉默前后的Focus细胞生长曲线、克隆形成能力以及细胞周期的变化.结果:与癌旁组织相比较,CSAG1基因在75%(9/12)肝癌组织中的表达量明显上调;沉默肝癌细胞株Focus中内源性CSAG1基因表达后,Focus细胞的生长明显减慢,克隆形成能力明显降低,S期细胞明显减少.结论:CSAG1可能是一个新的肝癌相关的促进基因,对其进行深入的研究有可能发现肝癌发病的新机制,也有可能发现肝癌治疗的新靶点.     

CTHRC1基因在人肝癌中高表达并促进MHCC97L肝癌细胞的转移

目的：分析CTHRC1基因在人肝癌组织和肝癌细胞株中的表达情况及其对MHCC97L肝癌细胞转移能力的影响。方法：采用northem blot、RT—PCR和荧光定量PCR分析人肝癌组织和肝癌细胞株中CTHRC1 mRNA水平。构建包含CTHRC1基因编码框的真核表达载体pCMV-3Tag-CTHRC1，通过体外实验分析CTHRC1在MHCC97L细胞中过表达对MHCC97L细胞迁移、侵袭等转移能力的影响。结果：Northern blot、RT—PCR和荧光定量PCR结果显示，14例肝癌患者中11例存在癌组织CTHRC1 mRNA表达水平高于癌旁组织，8种肝癌细胞株中5种肝癌细胞株存在着CTHRC1的高表达。当CTHRC1过表达后，MHCC97L细胞的迁移及侵袭能力显著增强（P〈0．001）。结论：CTHRC1基因在人肝癌组织和人肝癌细胞株中存在着高表达，同时该基因可使肝癌细胞MHCC97L的转移能力明显增强，提示CTHRC1基因可能在肿瘤转移中起重要作用。     

CPGL的基因结构及其与肝癌相关性的研究

目的 克隆carboxypeptidase of glutamate like(CPGL)全长cDNA，初步探讨它在肝癌发生发展中的作用。方法 通过5’-RACE方法和RT-PCR验证，确定(CPGL)全长序列，根据其全长与人类基因组的比较进而确定基因的染色体定位和其外显子、内含子；应用Western Blot方法检测CPGL在肝癌组织和癌旁组织中的表达；细胞克隆形成及生长曲线检测CPGL对肝癌细胞生长的影响。结果 CPGL全长2616bp，编码475个氨基酸的蛋白，染色体定位于18q22.3，蛋白产物定位于细胞质中，Western Blot结果发现CPGL在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。将CPGL转染肝癌细胞系SMMC7721发现其具有抑制生长的作用。同源比较发现CPGL含有M20蛋白酶家族的保守功能域。结论 上述发现表明CPGL是具有潜在抑癌作用的基因。     

一个肝癌相关基因的生物信息学及其基因表达分析

筛选并克隆肝癌相关基因，探讨肝癌发病机制。方法：在国家人类基因组南方研究中心肝癌基因表达谱及其功能研究的工作基础上，发现1个未知功能基因（暂命名LLC基因），其DNA拷贝数在肝癌基因组中呈降低的趋势。本研究利用生物信息学和RT-PCR的方法，对其进行功能预测并在转录组水平检测该基因的表达。结果：LLC基因定位于染色体8p23.3区段，全长为6706bp，含有2个外显子，1个内含子，其开放阅读框长为1871bp，编码1个含有623个氨基酸的蛋白。该基因在67%（16/24）肝癌组织中呈现下调趋势。同时其在人体内多种组织均有表达。结论：LLC基因有可能是一个新的肝癌相关抑癌基因。     

PNMA5基因在肝癌组织中的表达及功能研究

目的:研究功能未知基因PNMA5在肝癌组织中的表达及其与肝癌细胞生长的关系;方法:利用肝癌基因表达谱数据研究发现PNMA5基因在肝癌组织中高表达.采用RT-PCR及实时荧光定量-PCR(real-time fluorescemt quantitative PCR,RFQ-PCR)方法检测PNMA5在人类正常组织以及肝癌组织和癌旁组织中的表达水平;利用RNA干扰技术沉默肝癌细胞株(Focus和PLC)内PNMA5基因的表达;CCK-8实验定量分析内源性PNMA5基因被沉默前后的Focus和PLC细胞生长曲线的变化.结果:在14种人正常组织中,PNMA5只在睾丸、卵巢和脑组织中高表达,PNMA5基因在42%(5/12)的肝癌组织中有明显的上调(与癌旁组织比大干2倍以上,P＜0.05).沉默肝癌细胞株Focus和PLC中内源性PNMA5基因表达后.2种肝癌细胞的生长均受到明显的抑制(P＜0.01),同时,从G1期进入S期细胞明显减少(P＜0.01).结论:PNMA5在维持肝癌细胞恶性表型过程中可能起到重要的作用,可能是一个新的肿瘤一睾丸相关基因.进一步研究其功能有可能发现肝癌发病的新机制,成为肝癌治疗的新靶点.     

肝癌中具有高突变率位于染色体17p13.3区的新报癌基因

目的：以往研究表明肝癌中染色体17p13.3区有高频率的杂合性缺失，其最小杂合性缺失范围已被确定在D17S643至D17S1574位点间，而且其中的D17S926位点有最高的杂合性缺失率，含有该位点的基因组克隆P579已被测序分析，在P579范围共有13个新基因，这里报告其中的一个新基因（命名为肝癌抑癌基因1，HCCS1）的克隆和特性研究结果。方法：利用直接杂交筛选方法获得基因组克隆P579中的基因克隆，根据HCCS1基因克隆的cDNA序列与基因组序列进行比较确定基因的外显子与内含子，应用RT－PCR扩增组织中的HCCS1基因，序列测定检查突变，应用免疫组化检测HCCS1在组织中的表达，应用克隆形成试验和裸鼠成瘤试验检测HCCS1的生物学功能。结果：HCCS1有18个外显子，cDNA全长约2．0kb，蛋白产物定位于线粒体，HCCS1在肝癌细胞中有高频率的突变，免疫组化检测表明HCCS1在癌旁组织的表达明显高于癌组织，HCCS1转染肝癌细胞明显抑制其克隆的形成及在裸鼠体内的成瘤，结论：上述发现表明HCCS1具有肝癌抑癌基因的作用。     

酵母LAG1同源的人类长寿保障新基因LASS2的克隆和功能研究

目的　分离和克隆肝癌相关基因。方法　我们用高通量功能筛选和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因LASS2 (homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)。结果　LASS2在正常人肝组织和肾组织中高表达 ,其表达谱不同于早先在人中克隆到的另一个与酵母LAG1高度同源的人类长寿保障基因LAG1Hs- 1。放射杂交基因定位显示LASS2位于人类染色体 1q11,酵母双杂交和GST结合实验发现LASS2蛋白能与细胞中的几个膜相关受体或转运体相互作用 ;另外 ,LASS2在体外对人肝癌细胞的克隆形成具有抑制作用 ,提示该基因可能参与细胞的生长调控。结论　LASS2是一个新的肝癌相关基因。     

生物节律相关基因 Cry1与肝癌的相关性探讨

目的研究生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展的相关性.方法逆转录PCR、Northern blot和免疫组织化学方法检测Cry1在各种肿瘤细胞系、人正常组织及人肝癌与配对的癌旁组织中的表达.构建Cry1重组的真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721.生长曲线和软琼脂克隆形成试验检测Cry1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖速度.逆转录PCR检测与Cry1相互作用的生物节律基因在Cry1过表达的SMMC-7721中的表达.结果Cry1在人各种正常组织中均有不同程度的表达.Cry1在人肝癌癌旁组织中的表达水平高于癌组织中的表达.过表达Cry1对SMMC-7721细胞的体外增殖没有明显影响.结论生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展可能有一定的相关性.     

肝癌相关基因pp1158的表达及功能研究

目的 对pp1158基因的蛋白表达和体内外功能进行研究。方法 用pET-32a融合表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）对该基因进行表达,制备兔源性多克隆抗体;用体外细胞集落形成试验、裸鼠体内成瘤实验、免疫组化及蛋白印迹,检测该基因对肿瘤细胞生长的影响及表达差异;用Northern blot检测pp1158在组织中的表达差异。结果 pp1158对BEL 7402肝癌细胞系的体外集落形成有明显抑制作用,抑制率为58．3％（P＜0．01）;对BEL 7402细胞的成瘤有明显抑制作用（P＜0．05）。蛋白印迹结果显示,转染pCMV-Script-pp1158的BEL 7402细胞表达pp1158蛋白。免疫组化结果显示,pp1158基因在人组织中的表达为：正常肝组织≥癌旁肝组织＞肝癌组织。Northern blot结果显示,pp1158在人胎盘组织中高表达,在心、肝、骨骼肌、胰腺、肺等脏器中度表达,而在脑和肾组织中表达很低。结论 pp1158为肝细胞性肝癌的侯选抑瘤基因。     

MAGEA9基因在肝癌中的表达及RNAi沉默后对肝癌细胞生长和克隆形成的影响

目的研究基因MAGEA9在肝癌中的表达,以及被沉默后对肝癌细胞株Focus和PLC/PRF/5生长的影响。方法采用半定量RT-PCR方法检测MAGEA9基因在48例肝癌样本的癌和癌旁组织,14种人正常组织和17株人肝癌细胞株中的表达差异;同时观察沉默MAGEA9表达后肝癌细胞生长曲线和克隆形成能力的变化。结果与癌旁样本相比,MAGEA9基因在肝癌组织mRNA表达水平上调的比例为29%(14/48);在正常人体组织中局限于睾丸、心脏、脾脏、肾脏组织中表达;利用RNA干扰技术下调MAGEA9基因的表达后,Focus和PLC/PRF/5细胞生长受到明显的抑制;同时,PLC/PRF/5细胞克隆形成能力明显减弱。结论MAGEA9基因在维持肝癌细胞的恶性表型中可能起到重要的作用,因此它可能与肝癌发生发展有密切的关系,深入研究MAGEA9在肝癌中的功能,有可能为肝癌诊断发现新的指标或为肝癌治疗提供潜在的药物靶点。     

TRIM59调控波形蛋白促进人肝细胞肝癌细胞的增殖与迁移

目的:探讨三结构域蛋白59（tripartite-motif protein 59,TRIM59)对于人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)细胞增殖与迁移的影响以及波形蛋白（vimentin,VIM）作为其中潜在调控靶点的相关性研究。方法:通过细胞培养和细胞转染得到所需要的人HCC细胞，采用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测其中TRIM59 mRNA的表达水平并通过蛋白印迹法（Western blot）检测TRIM59蛋白质的表达水平；采用慢病毒介导的基因沉默效应与TRIM59过表达质粒进行转染介导的基因过表达效应调控TRIM59 基因的表达，通过集落形成试验检测TRIM59处于不同表达水平时的肝癌细胞系的增殖能力差别；通过细胞划痕试验检测TRIM59 基因处于不同表达水平时HCC细胞的迁移能力差异；并通过考马斯亮蓝法（Bradford法）检测TRIM59基因处于不同表达水平时，VIM的表达情况，通过统计学方法研究TRIM59及VIM表达的相关性。结果:通过定量qRT-PCR与Western blot检测，在所选取的HCC细胞系中，TRIM59 mRNA及TRIM59蛋白质的表达量均高于普通肝细胞（P均<0.01）。细胞集落形成实验显示，在所选的肝癌细胞中，TRIM59的表达与HCC的细胞集落形成数量呈正相关（P均<0.01）。细胞划痕试验显示,TRIM59的表达与HCC的细胞迁移能力呈正相关（P均<0.05）。Bradford法检测显示,在所选取的HCC细胞系中，TRIM59蛋白质的表达与VIM的表达呈正相关（P均<0.01）。结论:TRIM59 促进人HCC细胞的增殖与迁移，可能是通过调控VIM表达而完成，可为HCC的靶向治疗提供新的靶点。     

正反义人乙酰肝素酶真核表达体系构建及其意义的研究

目的:构建正反义人乙酰肝素酶(HPA)的肝癌细胞克隆表达体系,研究其对肝癌细胞转移潜能的影响。方法:建立正反义人HPA真核表达载体,脂质体法转染高转移人肝癌细胞系HCC-P,G418选择培养,以RT-PCR和免疫组织化学检测HPA mRNA及蛋白表达。细胞计数,MTT实验测定细胞生长状况。裸鼠尾静脉注射转染肿瘤细胞,30 d后称肺脏质量,计数肺表面转移结节数,比较不同转染细胞的转移潜能。结果:限制性内切酶及测序证实载体构建成功;RT-PCR证实,转染正反义载体的细胞在HPA mRNA水平上相差10.13倍;免疫组织化学证实,HPA高效稳定表达于转染正义载体的细胞胞质及胞膜上;细胞生长曲线和MTT实验表明,转染基因对细胞生长无明显影响,P>0.05。注射转染反义肝癌细胞组荷瘤鼠肺脏质量和肺表面转移结节数较对照组显著减少,正义组则相反,P<0.01。结论:成功克隆正反义人HPA,并稳定转染HCC-P。HPA基因对肝癌细胞转移潜能具有促进作用,而反义基因则抑制肿瘤的生长。     

重组腺病毒介导的人野生型p53、GM—CSF和B7—1基因在肝癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒载体对肝癌细胞的转染效率及其介导的人野生型p53，GM－CSF和B7－1基因在肝癌细胞中的表达。方法：不同MOI的Ad-GFP感染肝癌细胞，48h后计算感染效率；BB－102以50MOI感染肝癌细胞，48h后免疫组化法及western blot检测p53表达，ELISA检测GM0CSF的含量，FACS测定B7－1的表达。结果MOI为50pfu/细胞时对肝癌细胞的转染效率达80％以上，目的基因均可在肝癌细胞中高效表达。结论：腺病毒载体对肝癌细胞具有较高的转染效率，目的基因均可在肝癌细胞中高效表达，为进一步研究BB－102在肝癌治疗中的应用奠定了基础。     

Dickkopf(DKK1)在肝癌组织及多种人肿瘤细胞系中的表达分析

目的:检测dickkopf(DKK1)在肝癌组织及多种恶性肿瘤细胞系中的表达情况。方法:采用酶联免疫吸附实验、real time PCR、RT-PCR及Western blot对DKK1在肝癌组织及多种恶性肿瘤细胞系的表达情况进行检测。结果:肝癌组织检测RT-PCR,10/15肝癌中高表达;Real-time PCR方法检测,8/8肝癌中高表达;Western blot方法检测,5/8肝癌中高表达。酶联免疫吸附实验检测到DKK1在多种恶性肿瘤细胞系的细胞培养液上清液中均有表达,蛋白质表达量波动于5~210 ng/mL之间;10种人恶性肿瘤细胞系在mRNA水平和蛋白质水平DKK1的表达均能检测到。结论:DKK1高表达于肝癌组织及广泛表达于多种恶性肿瘤细胞系,提示DKK1可能在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。     

Highly efficient suicide gene expression in hepatocellular carcinoma cells by epstein-barr virus-based plasmid vectors combined with polyamidoamine dendrimer

The present study was aimed at devising an efficient nonviral strategy for suicide gene therapy of hepatocellular carcinoma (HCC). To improve the efficiency of DNA delivery and expression, we applied Epstein-Barr virus (EBV)-based plasmid vectors instead of conventional plasmid vectors and combined them with cationic liposome (EBV/lipoplex) or polyamidoamine dendrimer (PAAD) (EBV/polyplex). When the beta-galactosidase gene was transferred to HuH7, PLC/PRF/5, or HLE cells, < or =50-fold higher beta-galactosidase activities were demonstrated in the cells transfected with EBV vector compared with those transfected with conventional plasmid vectors. PAAD-mediated transfection of HCC with pSES.Tk (an EBV-based vector carrying the herpes simplex virus-1 thymidine kinase gene) resulted in a marked reduction in viable cell number by the addition of ganciclovir (GCV). The HCC cells transfected with pSES.Tk/PAAD showed 100- to 1000-fold higher susceptibilities to GCV than those transfected with pS.Tk (a conventional plasmid vector carrying herpes simplex virus-1 thymidine kinase gene)/PAAD. The pSES.Tk-transfected HCC cells were effectively killed by day 9 in culture with a clinically feasible concentration of GCV (25 microM), whereas the pS.Tk-transfected cells survived the culture. These results demonstrate highly efficient suicide gene transfer into various HCC cells by EBV-based plasmid vectors in vitro, suggesting the possible application of this nonviral vector system to gene therapy of HCC.     

MAT1-siRNA体外转染抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭能力的研究

目的:观察siRNA沉默MAT1基因对胰腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响,探讨MAT1基因作为胰腺癌基因治疗标靶的可行性。方法:在脂质体介导下将MAT1基因序列特异性siRNA体外转染人胰腺癌BxPC-3细胞,采用RT-PCR和W estern印迹法分析MAT1基因的表达,锥虫蓝染色计数法和Boyden小室模型分别测定细胞的增殖和体外侵袭能力变化。结果:与对照各组相比,实验组BxPC-3细胞MAT1 mRNA和蛋白在一定时间内均表达下调,其中mRNA表达在24 h和48 h分别下调达55.2%和64.3%(P<0.01);细胞体外增殖和侵袭能力均明显受抑,差异具统计学显著性(P<0.01)。结论:针对MAT1基因的siRNA可抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力,MAT1可能是胰腺癌基因治疗的靶点。     

逆转录病毒介导p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的观察人类野生型p53(wt p53)基因对人食管癌细胞系的抑制作用.方法用逆转录病毒为载体将外源性wt p53基因导入人食管癌细胞系ECA109,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用.结果 p53在转染细胞ECA109/p53中表达水平提高.外源性wt p53基因的导入和表达能使ECA109细胞的生长速率减低,软琼脂集落形成能力下降,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低,凋亡指数升高,裸鼠体内成瘤能力明显下降.结论逆转录病毒载体介导的外源性野生型p53能够抑制人食管癌细胞生长.     

两位点短发卡状RNA诱导AKT2基因沉默在卵巢癌细胞紫杉醇敏感性中的应用研究

目的：探讨AKT2基因在肿瘤细胞对紫杉醇敏感性中的作用。方法：分别构建2个针对同一AKT2基因不同位点的短发卡状RNA（shRNA）载体，转染人卵巢癌细胞A2780、SKOV3，荧光显微镜观察细胞内荧光蛋白的表达及转染效率，运用RT—PCR、蛋白质免疫印迹（western blotting）方法比较单独转染的抑制瘤和共转染对AKT2表达的沉默效率；抑制AKT2表达后，流式细胞仪（FACS）检测肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。结果：构建的2种shRNA表达载体均可抑制AKT2mRNA和蛋白的表达，共转染的抑制率明显高于分别单独转染的抑制率（P〈0．05）；FACS结果显示，共转染沉默AKT2基因后，细胞凋亡率明显增加（P〈0．05）。结论：共转染针对AKT2基因不同位点的2个shRNA真核表达载体，对AKT2基因的抑制效率高于单独转染1个载体；抑制卵巢癌细胞中AKT2基因表达，能增强其对紫杉醇的敏感性。     

miR-223-3p 通过靶向RAC1 调控肝细胞癌SMMC-7721 细胞的增殖和凋亡

目的：探讨miR-223-3p 通过调控Ras 相关C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1）对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法：选用2016 年8 月至2018 年8 月吉林市中心医院手术切除的30 例HCC 组织及其癌旁组织标本和人HCC 细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2 及人正常肝细胞QSG-7701，用qPCR检测HCC组织和细胞系中miR-223-3p的表达水平。分别将miR-223-3p mimics、miR-223-3p inhibitor 和siRAC1转染至SMMC-7721 细胞，通过CCK-8、克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术检测SMMC-7721 细胞的增殖、克隆形成和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因实验检测miR-223-3p 与RAC1 的靶向关系，Western blotting 检测细胞中RAC1 蛋白的表达水平。结果：miR-223-3p 在HCC组织的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.01），其表达水平与肿瘤大小、TNM分期及肿瘤分化病理特征相关（P<0.05 或P<0.01）；miR-223-3p 在HCC细胞系表达水平显著低于QSG-7701 细胞（均P<0.01），以在SMMC-7721细胞中表达水平最低。双荧光素酶报告基因实验证实RAC1 是miR-223-3p 靶基因，miR-223-3p 靶向负调控RAC1 的表达。转染miR-223-3p mimics 显著抑制SMMC-7721 细胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05 或P<0.01），并促进细胞凋亡（P<0.01）；转染miR-223-3p inhibtor 则逆转miR-223-3p mimics 对细胞的抑制作用。结论：过表达miR-223-3p 抑制HCC细胞增殖和克隆形成能力并促进细胞凋亡，其机制可能与靶向下调RAC1表达有关。