肝癌中具有高突变率位于染色体17p13.3区的新报癌基因

目的：以往研究表明肝癌中染色体17p13.3区有高频率的杂合性缺失，其最小杂合性缺失范围已被确定在D17S643至D17S1574位点间，而且其中的D17S926位点有最高的杂合性缺失率，含有该位点的基因组克隆P579已被测序分析，在P579范围共有13个新基因，这里报告其中的一个新基因（命名为肝癌抑癌基因1，HCCS1）的克隆和特性研究结果。方法：利用直接杂交筛选方法获得基因组克隆P579中的基因克隆，根据HCCS1基因克隆的cDNA序列与基因组序列进行比较确定基因的外显子与内含子，应用RT－PCR扩增组织中的HCCS1基因，序列测定检查突变，应用免疫组化检测HCCS1在组织中的表达，应用克隆形成试验和裸鼠成瘤试验检测HCCS1的生物学功能。结果：HCCS1有18个外显子，cDNA全长约2．0kb，蛋白产物定位于线粒体，HCCS1在肝癌细胞中有高频率的突变，免疫组化检测表明HCCS1在癌旁组织的表达明显高于癌组织，HCCS1转染肝癌细胞明显抑制其克隆的形成及在裸鼠体内的成瘤，结论：上述发现表明HCCS1具有肝癌抑癌基因的作用。     

CL-L1基因在肝癌中的表达及其功能研究

目的：通过对肝癌相关基因CL-L1表达的研究，探讨其在肝癌发病机制中的作用。方法：采用RT-PCR分析CL-L1基因在61例肝癌和癌旁组织中的表达差异；利用pcDNA3．1／Myc—His（-）B和pEGFP-N1载体将CL-L1基因转入PCI。肝癌细胞株，观察其克隆形成能力的变化以及该基因产物的亚细胞定位。结果：CL-L1基因在75．4％的肝癌组织中明显下调；该基因蛋白产物定位于细胞质中；CL-L1基因过表达引起PCL细胞的克隆形成能力明显下降。结论：CL-L1可能是一个新的肝癌相关的抑癌基因，对其进行深入研究有可能发现肝癌发病的新机制，也有可能发现肝癌治疗的新靶点。     

TC21/R-Ras 2在肝癌中的表达、亚细胞定位及意义

目的:探讨TC21基因在肝癌细胞、肝癌及癌旁组织中的表达、亚细胞定位及意义。方法:用RT-PCR检测TC 21在肝癌细胞系及人肝癌及癌旁组织中mRNA水平的表达,用免疫组化及Western印迹检测TC21蛋白在肝癌相关组织中的表达差异,用组织芯片技术结合免疫组化检测TC21蛋白的亚细胞定位。结果:RT-PCR检测结果表明TC21 mRNA在SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、Hep3B、HepG2、MHCC-97L、MHCC-LM3 7个肝癌细胞系及L-02和Chang liver 2株永生化人肝细胞系、7对肝癌及对应癌旁肝组织中均有较高表达;Western印迹结果表明上述细胞系中TC21蛋白表达与mRNA表达一致,TC21在4对肝癌及癌旁组织中均呈较高水平的表达;免疫组化检测结果表明TC21在人原发性肝癌、癌旁组织、硬化肝组织与正常肝组织中的表达阳性率分别为84.2%、77.2%、41.7%、0%,肝癌与肝硬化、正常肝相比显著高表达(P<0.05,P<0.01),与癌旁组织比无统计学意义(P>0.05);统计学分析结果表明TC21蛋白表达与肿瘤大小呈正相关(P<0.05),与是否肝硬化呈负相关(P<0.05);肝癌组织中TC21主要定位于肝癌细胞核,部分定位于胞质,膜定位不明显,TC21蛋白在肝癌细胞中的核定位显著高于癌旁肝细胞(P<0.001)。结论:本研究首次揭示TC21蛋白在肝癌组织中的高表达及核定位预示其在肝细胞恶性转化及肝癌发生发展中发挥重要作用。     

肝癌中具有高突变率位于染色体17p13.3区的新抑癌基因

目的　以往研究表明肝癌中染色体 1 7p1 3 .3区有高频率的杂合性缺失。其最小杂合性缺失范围已被确定在D1 7S643至D1 7S1 574位点间 ,而且其中的D1 7S92 6位点有最高的杂合性缺失率。含有该位点的基因组克隆P579已被测序分析 ,在P579范围共有 1 3个新基因。这里报告其中的一个新基因 (命名为肝癌抑癌基因 1 ,HCCS1 )的克隆和特性研究结果。方法　利用直接杂交筛选方法获得基因组克隆P579中的基因克隆。根据HCCS1基因克隆的cDNA序列与基因组序列进行比较确定基因的外显子与内含子。应用RT PCR扩增组织中的HCCS1基因 ,序列测定检查突变。应用免疫组化检测HCCS1在组织中的表达。应用克隆形成试验和裸鼠成瘤试验检测HCCS1的生物学功能。结果　HCCS1有 1 8个外显子 ,cDNA全长约2 .0kb ,蛋白产物定位于线粒体。HCCS1在肝癌组织中有高频率的突变 ,免疫组化检测表明HCCS1在癌旁组织的表达明显高于癌组织。HCCS1转染肝癌细胞明显抑制其克隆的形成及在裸鼠体内的成瘤。结论　上述发现表明HCCS1具有肝癌抑癌基因的作用     

肝癌及相关组织中NET-1基因与蛋白的表达

背景与目的:NET-1是最近发现的肿瘤相关基因,它在肝癌中的表达目前尚未见报道。本研究在胚胎肝、成人肝、肝癌及相应的癌旁组织中筛检和比较NET-1基因和蛋白表达,以探讨NET-1基因在肝癌表达的特征。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测3例胚胎肝、4例成人肝、4例验证肝癌组织和28例肝癌与相应癌旁组织中NET-1mRNA的表达,由四星图像分析系统软件检测NET-1基因mRNA的光密度。用基因生物工程方法制备NET-1多克隆抗体,并用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学检测培养的人肝癌细胞系SMMC-7721中NET-1抗体的表达,免疫组化法检测28例肝癌与癌旁组织中NET-1蛋白的表达。结果:(1)正常成人和胎儿肝组织中NET-1基因mRNA不表达,4例验证肝癌组织中NET-1基因mRNA均呈阳性表达;肝癌与癌旁组织中NET-1基因mRNA高表达,阳性率均为85.71%(24/28)。肝癌组织中NET-1mRNA的平均光密度显著高于癌旁组织(0.64与0.47,P<0.05)。(2)经激光共聚焦显微镜观察SMMC-7721细胞中NET-1抗体的表达定位于胞浆。(3)免疫组化检测NET-1多克隆抗体在同组肝癌和癌旁组织中NET-1蛋白检出率分别为96.43%(27/28)和71.43%(20/28),两者差异具有显著性意义(P<0.05)。(4)RT-PCR方法和免疫组化方法检测肝癌和癌旁组织中NET-1基因mRNA表达与蛋白表达两者之间阳性率无显著性差异,并呈显著性正相关(癌中r=0.48,癌旁r=0.40,均P<0.05)。结论:NET-1基因表达可能是肝癌发生的早期分子事件,该基因在肝癌诊断中可能有一定的参考价值。     

ZNRD1在肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响

[目的]检测ZNRD1基因在肝癌中的表达并探讨其对HepG2细胞增殖的影响.[方法]Western blot技术检测ZNRD1在7例肝癌组织和相应癌旁组织中的表达;脂质体介导法将ZNRD1的真核表达载体转染肝癌细胞系HepG2,G418筛选后应用Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度的变化.[结果]ZNRD1基因在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织;成功建立了ZNRD1高表达的肝癌细胞模型;转染后的肝癌细胞生长速度明显下降.[结论]ZNRD1基因可能参与肝癌的发生,对肝癌细胞的生长可能起重要调控作用,具备一定的基因治疗应用前景.     

新基因pp3774的亚细胞定位以及在肝癌细胞系和组织中的表达谱研究

目的探讨新基因pp3774在肝癌细胞系、人肝癌及癌旁肝、肝硬化以及正常肝组织中的表达差异及其生物学功能.方法脂质体转染-荧光观察pp3774-GFP融合蛋白的亚细胞定位;合成新基因pp3774特异性多肽,制备兔源性多克隆抗体;用RT-PCR、蛋白印迹、免疫细胞化学及免疫组化方法检测pp3774基因在7个肝癌细胞系及214例肝细胞癌、18例肝硬化及10例正常肝组织中的表达差异.流式细胞术检测转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡率.结果 pp3774蛋白主要定位于细胞质(内质网为主);RT-PCR检测结果表明pp3774 mRNA在肝癌细胞系BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L及HepG2中高表达,SMMC-7721、MHCC-LM3及人永生化肝细胞系L-02中度表达,而在Hep3B中低表达;肝癌及癌旁组织中pp3774 mRNA的表达表现为癌旁高于癌(P<0.05);免疫组化结果显示pp3774蛋白表达程度依次为正常肝≥肝硬化≥癌旁肝组织>肝癌.转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡发生率高于对照组约10%.结论 pp3774基因是一个具有抑制肝癌细胞生长功能的新基因.     

一个肝癌相关基因的生物信息学及其基因表达分析

筛选并克隆肝癌相关基因，探讨肝癌发病机制。方法：在国家人类基因组南方研究中心肝癌基因表达谱及其功能研究的工作基础上，发现1个未知功能基因（暂命名LLC基因），其DNA拷贝数在肝癌基因组中呈降低的趋势。本研究利用生物信息学和RT-PCR的方法，对其进行功能预测并在转录组水平检测该基因的表达。结果：LLC基因定位于染色体8p23.3区段，全长为6706bp，含有2个外显子，1个内含子，其开放阅读框长为1871bp，编码1个含有623个氨基酸的蛋白。该基因在67%（16/24）肝癌组织中呈现下调趋势。同时其在人体内多种组织均有表达。结论：LLC基因有可能是一个新的肝癌相关抑癌基因。     

人醛氧化酶蛋白在肝癌中的表达及其临床意义

目的:探讨人醛氧化酶(human aldehyde oxidase, hAOX)蛋白在肝癌细胞系、肝癌组织、癌旁肝组织、肝硬化及正常肝组织中的表达及其临床意义.方法:采用Western印迹法和免疫组织化学法检测hAOX蛋白在7个肝癌细胞系、2个永生化肝细胞系、10例正常肝、12例肝硬化、57例肝癌及癌旁肝组织中的表达差异,分析其表达差异的临床意义.结果:Western印迹法检测结果表明,hAOX蛋白在MHCC-LM3、Hep3B、Huh-7和BEL-7402肝癌细胞系以及人永生化肝细胞系L-02和Chang's liver等6个细胞系中均有较高表达,在MHCC- 97L、 HepG2和SMMC-7721细胞中则为低表达.免疫组织化学检测发现,hAOX在正常肝、肝硬化组织和癌旁肝组织中高表达,在癌旁肝组织中的表达较匹配肝癌组织的高(P<0.001).Western印迹法检测结果提示癌旁肝组织中hAOX表达明显高于肝癌组织.hAOX表达与肝癌患者性别、年龄、血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平、乙肝表面抗原、肿瘤大小、病理学分级以及是否伴有肝硬化均无相关性(P>0.05),而与肿瘤血管侵犯和肿瘤生长方式有一定的相关性(P=0.053, P=0.011).结论:hAOX在正常肝、肝硬化、癌旁肝组织中高表达,而在肝癌组织中表达明显降低,其表达可能会影响肝癌的血管侵犯和肿瘤生长方式.     

肝癌组织CT抗原基因CSAG1表达及体外对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨CSAG1(chondrosar-coma associated gene 1)基因在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生长增殖的影响,为了解肝癌发生的分子机制奠定理论基础.方法:利用半定量RT-PCR技术检测CSAG1基因在12例肝癌和癌旁组织中的表达差异;RNA干扰技术沉默肝癌细胞株(Focus)内CSAG1基因的表达;利用CCK-8、克隆形成实验以及流式细胞仪分别定量分析内源性CSAG1基因被沉默前后的Focus细胞生长曲线、克隆形成能力以及细胞周期的变化.结果:与癌旁组织相比较,CSAG1基因在75%(9/12)肝癌组织中的表达量明显上调;沉默肝癌细胞株Focus中内源性CSAG1基因表达后,Focus细胞的生长明显减慢,克隆形成能力明显降低,S期细胞明显减少.结论:CSAG1可能是一个新的肝癌相关的促进基因,对其进行深入的研究有可能发现肝癌发病的新机制,也有可能发现肝癌治疗的新靶点.     

Tumor suppressor XAF1 induces apoptosis,inhibits angiogenesis and inhibits tumor growth in hepatocellular carcinoma

X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-associated factor 1 (XAF1), a XIAP-binding protein, is a tumor suppressor gene. XAF1 was silent or expressed lowly in most human malignant tumors. However, the role of XAF1 in hepatocellular carcinoma (HCC) remains unknown. In this study, we investigated the effect of XAF1 on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular cancer cells. Our results showed that XAF1 expression was lower in HCC cell lines SMMC-7721, Hep G2 and BEL-7404 and liver cancer tissues than that in paired non-cancer liver tissues. Adenovirus-mediated XAF1 expression (Ad5/F35-XAF1) significantly inhibited cell proliferation and induced apoptosis in HCC cells in dose- and time- dependent manners. Infection of Ad5/F35-XAF1 induced cleavage of caspase -3, -8, -9 and PARP in HCC cells. Furthermore, Ad5/F35-XAF1 treatment significantly suppressed tumor growth in a xenograft model of liver cancer cells. Western Blot and immunohistochemistry staining showed that Ad5/F35-XAF1 treatment suppressed expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), which is associated with tumor angiogenesis, in cancer cells and xenograft tumor tissues. Moreover, Ad5/F35-XAF1 treatment prolonged the survival of tumor-bearing mice. Our results demonstrate that XAF1 inhibits tumor growth by inducing apoptosis and inhibiting tumor angiogenesis. XAF1 may be a promising target for liver cancer treatment.     

Sox2在肝癌中的表达及其对细胞生长增殖的作用

[目的]明确Sox2蛋白在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达,探讨Sox2分子对肝癌细胞生长增殖的作用及机制。[方法]选取临床肝癌组织标本、正常肝细胞系和多种肝癌细胞系为实验对象,从蛋白水平比较Sox2的表达水平;选取高表达Sox2的肝癌细胞系,利用RNA干涉技术降低Sox2表达,运用BrdU掺入实验、MTT实验等技术检测Sox2分子对肝癌细胞生长、增殖的影响,并检测肿瘤相关分子Wnt/β-catenin的表达水平。[结果]Sox2在肝癌组织及几种肝癌细胞中表达明显升高,以HepG2细胞系最多;MTT实验显示,与正常对照组和阴性对照组比较,从第3天开始Sox2干涉组A。值明显降低（P〈0．05）;BrdU掺人实验显示,Sox2干涉组细胞BrdU掺入率明显减少（P〈0．05）;降低Sox2表达后,Wnt/β-catenin水平明显降低。[结论]Sox2在肝癌组织及肝癌细胞中表达升高,并通过Wnt/β-catenin促进肝癌细胞生长及增殖。     

生物节律相关基因 Cry1与肝癌的相关性探讨

目的研究生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展的相关性.方法逆转录PCR、Northern blot和免疫组织化学方法检测Cry1在各种肿瘤细胞系、人正常组织及人肝癌与配对的癌旁组织中的表达.构建Cry1重组的真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721.生长曲线和软琼脂克隆形成试验检测Cry1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖速度.逆转录PCR检测与Cry1相互作用的生物节律基因在Cry1过表达的SMMC-7721中的表达.结果Cry1在人各种正常组织中均有不同程度的表达.Cry1在人肝癌癌旁组织中的表达水平高于癌组织中的表达.过表达Cry1对SMMC-7721细胞的体外增殖没有明显影响.结论生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展可能有一定的相关性.     

miR-29a靶向调控CLDN1抑制肝癌细胞增殖的实验研究

目的:探讨miR-29a在肝癌组织中的表达水平，及其对人肝癌细胞增殖能力的影响。方法:通过RT-PCR测定肝癌组织及非肝癌组织中miR-29a的表达水平；将携带miR-29a的脂质体miR-29a mimic、空载体miR-NC以及miR-29a抑制剂anti-miR-29a转染入肝癌细胞系HepG2和HLE，通过RT-PCR方法检测miR-29a对肝癌细胞系HepG2、HLE增殖能力影响；通过Targetscan软件预测miR-29a靶基因，采用Western blot及荧光素酶实验验证。结果:与非肝癌组织比较，miR-29a在肝癌组织中表达下调，MTT实验提示:miR-29a高表达组肝癌细胞增殖能力较弱，miR-29a低表达组肝癌细胞增殖能力提高。Targetscan软件提示:CLDN1可能为miR-29a靶基因，Western blot及荧光素酶实验提示:与阴性对照组相比，miR-29a高表达组内CLDN1表达下降，相反miR-29a低表达组内CLDN1表达增加。结论:miR-29a在肝癌细胞及组织中表达下调，并且可能通过调控CLDN1影响肝癌细胞增殖能力。     

Beclin1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

 目的检测人非小细胞肺癌标本中自噬相关基因Beclin1的表达并讨论其意义及与细胞病理类型和临床分期的关系。方法采用免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法检测54例非小细胞肺癌的肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织Beclin1蛋白、mRNA表达。结果免疫荧光染色显示Beclin在肺癌组织中表达较低，表达率为8．3％，显著低于癌旁和正常组织（P=0．00）。Beclin1 mRNA在肺癌、癌旁及正常组织中的相对表达量为1．302±0．074、1．691±0．100、1．673±0．081（F=6．6，P=0．002），Western blot检测Beclin1蛋白在肺癌、癌旁、正常组织中的相对表达量分别为3．489±0．293、5．306±0．459、6．329±0．580（F=9．73，P〈0．01）。Beclin1蛋白和mRNA表达与肺癌病理组织类型和临床分期无明显关系。结论Beclin1蛋白和mRNA表达在肺癌组织中明显低于癌旁和正常组织，表达量的差异有统计学意义，在癌旁和正常肺组织中表达接近。     

miR-199-3p通过对FGF2的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移作用及机制

目的:探讨miR-199-3p通过靶向调控抑制靶基因FGF2从而抑制肝癌MHCC97H细胞的增殖和迁移及机制。方法:qRT-PCR检测癌旁正常组织及肝癌肿瘤组织中miR-199-3p的表达水平;Transwell细胞侵袭实验检测肝癌细胞株Huh7、MHCC-97L、SMMC7721、HepG2和MHCC97H株其侵袭能力;qRT-PCR检测miR-199-3p在5株肝癌细胞系中的表达量;通过生物信息软件预测靶基因FGF2 mRNA 3' UTR的碱基存在miR-199-3p可能互补结合的位点并用荧光报告基因法及WB进行验证;通过qRT-PCR、免疫组化及Western blot检测FGF2在肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织及各类肝癌细胞株表达的影响;Transwell、划痕、CCK8及流式细胞法检测miR-199-3p与FGF2对肝癌MHCC97H细胞增殖、侵袭、迁移及周期S期聚集能力的调控;采用MHCC97H细胞构建肝癌肿瘤异种移植小鼠模型进行肿瘤观测及免疫组化实验验证miR-199-3p对肝癌的调控作用。结果:miR-199-3p的表达水平与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p能够通过抑制FGF2的mRNA翻译,抑制FGF2蛋白水平表达;FGF2与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p可以负调控FGF2抑制肝癌MHCC97H细胞的生物行为;miR-199-3p 可抑制肝癌细胞中阳性信号,细胞增殖水平显著降低。结论:miR-199-3p通过抑制FGF2抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖和迁移。     

冬凌草甲素抑制人肝癌SMMC．7721细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制研究

目的研究冬凌草甲素对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的抑制作用及诱导凋亡机制。方法采用不同浓度的冬凌草甲素作用于人肝癌SMMC-7721细胞,以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞抑制率,倒置显微镜观察不同浓度组的细胞形态,RT—PCR法检测细胞Survivin、Bcl-2、BaxmRNA的表达,WesternBlot法检测细胞Survivin、Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果MTT比色法显示不同浓度的冬凌草甲素可抑制人肝癌SMMC．7721细胞的增殖,抑制作用呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用48h后细胞表现出特异性凋亡。RT—PCR法和WesternBlot法显示,人肝癌SMMC-7721细胞的BaxmRNA和Bax蛋白随冬凌草甲素浓度增加而表达增加,Bcl-2、SurvivinmRNA和Bcl-2、Survivin蛋白随药物浓度增加而表达下降。结论冬凌草甲素能抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,降低Sur—vivin、Bcl-2表达和上调Bax表达可能是诱导细胞发生凋亡的机制。