流感病毒快速检测法对甲型H1N1流感的临床诊断价值

目的 评价国产（A型）流感病毒快速检测试剂盒（广州万孚生物技术有限公司,中国）对甲型H1N1流感的临床诊断价值.方法 对2009年10月20日～11月23日本院发热门诊的符合流感样病例的患者35例,使用国产（A型）流感病毒快速检测试剂盒进行鼻拭子甲型H1N1流感病毒快速检测（简称快速试纸法）,同时取咽拭子行聚合酶链式反应（PCR）检测.结果 快速试纸法检测病毒阳性率为68.5%,PCR法流感病毒检出率为60%.与PCR法相比,前者的敏感性为90.4%,特异性为64.2%,阳性预测值79.1%,阴性预测值为81.8%.结论 快速试纸法检测有较高的敏感性,可以满足临床快速诊断甲型H1N1流感的需要.     

人类流感病毒多重PCR分型方法的建立

目的建立一种可以同时检测人类A型流感病毒,B型流感病毒及A型流感病毒H1,H3,H5亚型的多重RT-PCR方法。方法根据人类流感病毒的特异性基因设计并合成多对特异性引物,建立可同时扩增出人类流感病毒亚型特异性片段的多重PCR的方法。同时,对该方法的特异性和敏感性进行了评价,并利用该方法对39份疑似swineH1N1的临床标本进行检测。结果该方法可同时扩增出A型流感病毒M基因203bp,B型流感病毒M基因296bp,A型流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为362bp（H1）,112bp（H3）,188bp（H5）,494bp（swineH1）。该实验最低可检测新甲型H1N1（A/Beijing/501/2009）病毒RNA0.5TCID50。该方法的特异性实验结果显示,在多重PCR检测中未检出非特异扩增的PCR产物。同时,使用该方法从39份疑似新甲型H1N1的临床咽拭子标本中检测出新甲型H1N1阳性的标本4份（10.2%）,季节性H1N1亚型2份（5.1%）,H3N2亚型12份30.7%,本次实验结果与WHO通过实时PCR方法检测的结果一致。结论本研究建立的多重PT-PCR方法快速、敏感,特异性强,可用于人类流感病毒的分型检测。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化及变异特征分析

目的 了解自2009年3月新型甲型H1N1流感流行以来,其主要免疫原件基因-HA基因的进化及氨基酸变异特性.方法 从NCBI下载2009年新型甲型H1N1流感病毒以及北美地区、欧洲地区、亚洲地区以往流行的甲型H1N1流感病毒HA基因序列,利用MEGA 4.0软件对所选序列进行基因进化系统发育树分析;对2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因的核苷酸同源性及氨基酸特异性进行分析,并与北美地区、欧洲地区、亚洲地区分离株进行比较.结果 2009年新型甲型HlNl流感病毒HA基因与2006-2007年美国A/swine/H1N1流感病毒同源性最高,核苷酸序列差异为0%～0.8%;与美国各州1930-2007年分离的A/swine/H1N1流感病毒具有明显的时间上的进化关系;与欧洲及亚洲地区A/swine/H1N1流感病毒进化无关.其重要的抗原性位点与A/human/H1N1流感病毒及流感疫苗株存在较大差异.全球流行半年多以来该病毒株没有发生明显变异.结论 2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因是北美A/swine/H1N1流感病毒长期进化的结果,目前尚未发现明显抗原位点的变异.     

实时RT-PCR检测甲型H3N2流感病毒R292K耐药位点

目的建立快速检测甲型H3N2流感病毒神经氨酸酶（NA）奥司他韦耐药突变位点的实时RT-PCR方法。方法通过设计特异性靶向NAR292K突变位点的Taq-MGB探针进行实时RT-PCR反应,并利用模拟样本和临床标本进行灵敏性和特异性评价。结果与结论建立了快速检测NAR292K位点的实时RT-PCR检测方法;本方法灵敏性高,可检测低至500拷贝/μl;特异性好,与无耐药突变的甲型H3N2流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,为流感耐药监测提供了有效工具。     

大流行甲型H1N1流感病毒变异株的小鼠感染实验研究

目的对甲型H1N1流感病毒变异株的小鼠感染特征进行观察。方法经过体外鸡胚/MDCK细胞传代和筛选,获得1株甲型H1N1流感病毒变异株（vCA07）;使用不同剂量流感病毒滴鼻感染BALB/c小鼠后,计算半数致死量和半数感染量,观察小鼠感染后的体质量变化、肺部病毒增殖、肺部组织病理变化等。结果与野生型毒株相比,甲型H1N1流感病毒变异株对BALB/c小鼠的致病性显著提高,其可在小鼠肺组织中高效增殖,并导致显著的病理损伤。结论甲型H1N1流感病毒变异株感染特征得以明确,为进一步建立高致病性甲型H1N1流感病毒的小鼠感染模型以及大流行甲型H1N1流感病毒致病机制的研究奠定了基础。     

甲型H1N1流感的病原学及其治疗药物

目的介绍甲型H1N1流感[Influenza A（H1N1）]的病原学特征及其治疗药物,为甲型H1N1流感的临床治疗提供依据。方法收集专业书刊和网站资料,介绍卫生部制定的甲型H1N1流感诊疗方案,综合分析抗甲型H1N1流感病毒药物。结果此次疫情是由变异后的甲型H1N1流感病毒[Influenza virus A（H1N1）]引起,该毒株是猪流感、禽流感和人流感3种病毒的基因重组;只要及时服用抗流感病毒药物达菲（Tamiflu）,患者可以基本治愈。结论甲型H1N1流感远没有非典和禽流感那么可怕,我们即有防控非典的经验,又有疗效确切的抗病毒药,所以甲型H1N1流感是可防、可控、可治的。     

噬菌体展示技术筛选甲型H1N1流感病毒抗原模拟表位的研究

目的筛选特异性甲型H1N1流感病毒抗原模拟表位。方法应用噬菌体表面展示技术,以2009年甲型H1N1流感康复患者的血清作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机环七肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增筛选。从顶部琼脂噬菌斑中随机挑取32个克隆至处于对数生长期的大肠埃希菌中培养,采用ELISA,交叉反应以及竞争抑制性实验筛选并鉴定阳性克隆,对阳性克隆进行DNA序列分析,对其编码的展示于噬菌体表面的氨基酸序列与流感病毒血凝素(HA)基因进行同源性比较,确定甲型H1N1流感病毒抗原的模拟表位。结果从随机挑选的32个克隆中得到12个阳性克隆,确定氨基酸序列PLHARLP为甲型H1N1流感病毒抗原的模拟表位,其表位由HA的第52,53,59,60,61,83,271位氨基酸共同构成。结论用噬菌体环七肽库筛选得到甲型H1N1流感病毒的模拟表位,为开展用流感病毒模拟表位探索新的流感防治方法奠定了基础。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒全基因组序列重组分析及同源性比对

目的 分析2009年新型甲型H1N1流感爆发以来流感病毒的全基因组进化变异及重组情况.方法 从NCBI基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流感病毒(A/H1N1)代表性全基因组序列,先用MEGA4.0软件对8个基因序列片段进行比对和拼接;然后将历史上流行的H1N1、H5N1、H3N2等不同宿主(人、禽、猪)的流感病毒全基因组序列用MEGA做比对拼接,并用NJ法构建进化树.采用Simplot 3.5.1软件分析2009年新型甲型H1N1流感病毒基因重组情况.结果 自2009年3月爆发新型甲型H1N1流感以来,截至9月,病毒基因没有出现变异,同源性为99.69%～99.93%.基因重组分析显示,新型甲型H1N1病毒株PIE、PBI、PA、HA、NP和NS基因来源于近年来北美地区猪源人H1N1,同源性分别为95.25%,95.08%,95.21%,93.52%,95.23%,94.78%;NA和MP与欧洲地区猪H1N1同源性较高,分别为90.21%,94.43%.全基因序列同源性分析发现2009年新型甲型H1N1流感病毒与北美地区猪H1N1病毒同源性最高,为92.22%.结论 2009年新型甲型H1N1流感病毒是由2005年北美地区猪H1N1病毒与欧洲猪H1N1的NA和MP片段重排进化而成,新病毒暂未发生变异,H1N1新流感疫苗具有保护作用.     

一株新型甲型H1N1流感病毒H275Y的奥司他韦耐药变异分析

目的 探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化规律,分析NA蛋白酶活性位点以及糖基化位点变化情况.方法 从NCBI检索获得110株不同年代、不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用MEGA 4.0软件进行基因进化分析,并用NJ法构建进化树;对NA基因核苷酸序列同源性及编码蛋白氨基酸序列进行分析.结果 2009年新型甲型H1N1流感病毒世界各地不同毒株间的NA基因同源性极高,达到99.5%～100%,但与以往甲型H1N1人流感病毒的NA基因差异较大.2009年新型甲型H1N1流感病毒与欧洲A/swine/H1N1的NA基因同源性高,达到89.6%～92.9%,且糖基化位点分布一致,分别在50、58、63、68、88、146、235和386位存在糖基化现象.另外2009年新型甲型H1N1流感病毒与A/chicken/H5N1的NA基因同源性也较高,达到83.6%～85.3%.绝大部分2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA蛋白酶活性中心及周围相关位点氨基酸组成保守,仍然表现为R118、D151、R152、R225、E277、R293、R368、Y402、E119、R156、W179、S180,D199、1223、E228、H275、E278、N295和FA25,但丹麦、日本、我国香港及湖南分离到的4株病毒出现H275Y突变.2009年新型甲型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧洲A/swine/H1N1流感病毒,并与A/chicken/H5N1病毒有较近的亲缘关系.结论 2009年新型甲型H1N1流感病毒并非由以往人H1N1流感病毒逐渐进化而来,而是一种新型重排病毒,我国湖南地区发现的一株新型甲型H1N1流感病毒具有H275Y奥司他韦耐药变异.     

民航飞行员感染甲型H1N1流感病毒二例

一、临床资料 例1,男性,46岁,民航B737客机机长,飞行时间20 000 h.2009年7月,患者与其儿子(在英国感染了甲型H1N1流感病毒)密切接触7 d后出现"咽痛、发热",体温38.2℃,门诊就医:①行甲型H1N1流感病毒核酸检测;②服用利巴韦林(0.2 g,3次/d)、头孢丙烯咀嚼片(0.25 g,2次/d)治疗.与其儿子密切接触第9天,甲型H1N1流感病毒核酸检测报告为阳性,即刻住院隔离治疗.予口服奥司他韦胶囊治疗5 d(0.15 g,1次/d),服药1 d后体温正常,服药后第10天,甲型H1N1流感病毒核酸检测报告为阴性.痊愈出院.出院后地面观察39 d,恢复飞行.     

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因的遗传特性及重要功能位点变异分析

目的 分析2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶PA、PB1和PB2编码基因序列遗传的进化特征及重要功能位点变异.方法 从NCBI流感数据库中获取此次流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及不同年代、不同地区、不同宿主、不同亚型的参考序列,运用MEGA4.0软件比对和修剪此次流行株的代表序列和所有参考株序列.并用NJ法构建进化树,同时比对此次流行株的代表序列、各年代人的A/H1N1以及禽流感病毒参考序列等编码的PB2蛋白质序列.结果 不同地区、不同时间分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PBl和PB2编码基因同源性均>99.8%,且聚集在一枝独特的进化枝上,与禽流感病毒接近.进化树显示三者来源皆为禽类,目前仍未发生突变;PB2的重要功能位点第627位氨基酸为谷氨酸,具有禽流感病毒的特点.结论 本次流感大流行为新型甲型H1N1病毒导致的同源爆发.但还不具备典型的高致病性,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程.     

人源H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性和致病性研究

目的观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性,对比研究不同空斑类型H5N1病毒致病性和复制能力差异。方法将不同稀释度的H5N1亚型禽流感病毒株分别接种于MDCK单层细胞,加盖营养琼脂,合适时间染色,观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑形成特点,按照DullbeccoR的方法计算病毒PFU数;根据空斑大小进行挑选、纯化、筛选不同类型空斑病毒,测定这些病毒对Balb/c小鼠致病性差异和在MDCK细胞上复制差异。结果野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,空斑大小、形状差异明显:A/Vietnam/1194/2004(H5N1)以大圆形斑为主,夹杂少量小点状斑。A/Beijing/01/03(H5N1)大多数为中等大小空斑,并有少数针尖状斑。野生A/Vietnam/1194/2004经过分离纯化后,得到的两种空斑类型病毒在致病性和复制能力存在明显差异。结论野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,从野生病毒株中分离、纯化的大小斑病毒在致病性和复制能力上存在明显差异。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白基因进化的新探讨

目的 探讨甲型H1N1流感病毒基质蛋白(M)基因的进化规律及M2蛋白的氨基酸替代情况.方法 从NCBI数据库下载甲型H1N1病毒M基因179条进行预分析,最终选取50条采用MEGA 4.0软件对其进行比对,采用NJ法构建进化树,同时采用MEGA 4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对.结果 不同地区新型甲型H1NI流感病毒M基因同源性高,达99.6%～100.0%,但与历史上流行的H1N1和H3N2流感病毒M基因差异较大,仅与1999-2002年间香港地区流行的H3N2亚型猪流感病毒同源性较近,为96.7%~97.7%.2009年流行的新型甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H1N1人流感病毒相比,在第11、13、14、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来流行的H1N1禽流感病毒相比,在第13、14、16、31、43、55、77、89位氨基酸位点发生了变异;与H1N1猪流感病毒相比,在第13、14、19、43、55位氨基酸位点发生了变异.2009年流行的甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H3N2人流感病毒相比,在第11、13、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来在欧亚大陆流行的猪流感病毒相比,所比较的19个位点均有部分毒株发生变异;而与1999-2002年间在香港流行的H3N2猪流感病毒相比,仅在第13、14、21、43位氨基酸位点发生变异.结论 此次新型甲型H1N1流感病毒M基因可能由香港地区流行的H3N2猪流感病毒重组而来.M2蛋白胞外编码区氨基酸位点发生变异,提示在疫苗研制方面应注意由此带来的影响.跨膜区的突变可能是导致此次新型甲型H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药性的原因,第43位氨基酸位点可能为引起此次耐药的主要位点.     

重症甲型H1N1流感患者临床救治回顾分析

目的探讨ICU救治重症H1N1流感患者的临床特点以及经验。方法回顾分析2009年11月11日,2010年2月3日35例人住我院ICU救治的重症甲型HINl患者的临床资料。初步分析治疗与预后的因果关系。结果35例重症甲型H1N1患者合并有基础疾病者22例（62．8％）,妊娠中晚期病者11例（31．4％）,体重指数在30-39的患者10例（28．5％）。人院后均给予抗病毒（奥司他韦）治疗及对症支持和器官保护治疗,发展至重症阶段均给予抗生素、糖皮质激素抗炎、营养支持、免疫调节、人工通气辅助等治疗措施。27例最终病愈出院（77．1％）,其中13例出院时X线胸片示有轻微的肺纤维化及肺大泡形成（37．1％,13／35）,6例死亡（病死率17．1％）。结论重症甲型H1N1流感病情发展迅速。除了提倡早诊断,早治疗外,早期使用奥司他韦及合理使用糖皮质激素和人工通气辅助效果理想。     

北京市房山区甲型H1N1流感抗体血清流行病学调查

 目的 了解北京市房山区人群甲型H1N1流感免疫水平,为完善该区甲型H1N1流感疫情防控措施提供科学依据.方法 选择房山区常住人口784名,按照年龄组进行分层和问卷调查,采集血清标本进行甲型H1N1流感病毒血凝抑制(hemagglutination-inhibition,HI)抗体检测,比较不同人群甲型H1N1流感保护性抗体阳性率和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT).结果 784名调查对象甲型H1N1抗体阳性率为40.9%(321/784),抗体几何平均滴度为1∶ 18.39.6~15岁年龄组抗体阳性率最高(57.5%),其次是16~24岁年龄组(54.7%),而≥60岁年龄组HI抗体阳性率最低(21.2%).非条件多因素logistic回归分析显示,年龄及接种甲型H1N1流感疫苗与HI抗体阳性呈显著性相关.结论 房山区有超过40%的人群具有甲型H1N1流感保护性抗体,普通人群中已经建立一定的免疫屏障.