人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4（Par-4）基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Par-4,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞总蛋白,Western blotting检测Par-4表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Par-4载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达。结论　pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

HBx基因重组腺病毒载体构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:利用pAdEasy1腺病毒载体系统构建人HBx基因重组腺病毒,感染肝癌细胞株SMMC7721使HBx基因有效表达。方法:自真核表达载体pcDNA3.1(-)HBx中获得HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中构建pAdTrackCMVHBx,然后经PmeⅠ酶切线性化,电转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中。挑选和鉴定正确的同源重组质粒,然后将线性化的重组质粒转染293N细胞,产生重组病毒颗粒,并进一步感染SMMC7721细胞株。结果:经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pAdTrackCMVpAdEasy1HBx重组成功,借助荧光显微镜可以观察到绿色荧光蛋白GFP在293N和SMMC7721细胞株中表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,并在SMMC7721细胞中使HBx基因有效表达,为后续研究奠定了基础。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

CXCL16基因与红色荧光蛋白pDsRed2-N1融合基因表达载体的构建

目的:构建人趋化因子配体16(CXC ligand 16,CXCL16)与增强型红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,使CXCL16-RFP融合蛋白在人293T细胞中稳定表达。方法:针对CXCL16基因设计引物,扩增人CXCL16 cDNA,退火后插入含有RFP的表达载体pDsRed2-N1。测序正确的CXCL16和RFP的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,经脂质体转染人293T细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株。荧光显微镜观察细胞转染情况,Western blotting比较转染前后293T细胞中CXCL16蛋白的表达变化。结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,CXCL16基因已正确插入pDsRed2-N1中RFP基因的上游,获得融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16。空载体pDsRed2-N1和融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16经脂质体转染人293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到表达RFP的细胞发出红色荧光,转染效率分别可达95%和85%。pDsRed2-N1/CXCL16转染293T细胞后,CXCL16蛋白的表达水平显著上调。结论:成功构建的pDsRed2-N1/CXCL16融合基因表达载体可在293T细胞中稳定表达CXCL16蛋白,为进一步研究CXCL16在细胞增殖调控中的作用奠定了基础。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

ABCE1基因pEGFP重组表达载体构建及转染小细胞肺癌细胞

目的:构建ABCE1基因的pEGFP重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1,并将其转染至小细胞肺癌细胞(NCI-H446),观察其表达,并检测转染前后细胞增殖情况.方法:RT-PCR扩增ABCE1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1重组获得重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1.经酶切,电泳,DNA测序鉴定后应用Fugene-HD将重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1及空载体pEGFP-C1分别转染NCI-H446细胞,观察pEGFP-C1-ABCE1和pEGFP-C1在小细胞肺癌细胞的表达,MTT法检测转染ABCE1基因对小细胞肺癌细胞增殖的影响.结果:ABCE1基因cDNA片段成功重组到pEGFP-C1载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的cDNA片段为ABCE1基因.荧光显微镜观察转染pEGFP-C1- ABCE1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白主要在胞浆表达而转染pEGFP-C1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白在胞浆及胞核均有表达.MTT实验提示转染pEGFP- C1-ABCE1的细胞与转染pEGFP-C1和未转染的同类细胞相比增殖能力明显增加.结论:成功构建了pEGFP-C1-ABCE1真核细胞重组表达载体,并将该载体转染入小细胞肺癌细胞,该载体的绿色荧光主要在NCI-H446细胞胞质表达,提示ABCE1基因可能主要在胞质表达.该基因与小细胞肺癌的增殖活性有关.     

携带靶向沉默LSD1基因表达shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建慢病毒干扰LSD1表达的载体并鉴定。方法:设计并合成3对针对LSD1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒连接,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人胃癌MKN-28细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过real time-PCR法检测细胞中LSD1基因的表达水平。结果:经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒构建成功;转染胃癌MKN-28细胞后,LSD1基因在mRNA水平的表达降低。结论:成功构建了靶向LSD1基因的shRNA慢病毒载体,并筛选出1种对LSD1基因有显著抑制作用的shRNA。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

真核表达质粒PIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：通过oligo化学合成及PCR扩增法合成人显性抑制TGF-βⅡ型受体目的基因,并建立其真核表达载体。方法：根据Genebank数据库确定显性抑制TβRⅡ目的基因,利用化学合成法进行单链oligo的合成,PCR法将合成的oligo拼接成完整的序列,装入PMD18-T载体并转染感受态细胞DH5。经XhoI和Eco-RI酶切后连接至目的载体PIRES2-AcGFP中,转染COS-7细胞,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测DNTβRⅡ表达。结果：合成DNA经测序验证与目的基因一致;PIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ转染COS-7细胞,实现了DNTβRⅡ目的基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达。结论：采用oligo化学合成及PCR扩增法成功合成人显性抑制TGF-βⅡ型目的基因并构建了其真核表达载体PIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ,为进一步研究过继性免疫细胞治疗奠定了基础。     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

构建STK11基因融合质粒检测其对肺癌细胞迁移能力的影响

目的 构建表达STK11（serine/threonine kinase 11,STK11）基因和报告基因EGFP融合蛋 白的重组质粒,并转染肺癌A549和H460细胞株,检测其对肺癌细胞迁移能力的影响。方法 构建重 组质粒pEGFP-STK11,双酶切和测序进行鉴定。重组质粒转染A549和H460细胞株,荧光显微镜观察 EGFP蛋白表达情况,Western blot检测STK11蛋白表达情况,划痕实验检测其对肺癌细胞迁移能力的 影响。结果 酶切和测序结果表明pEGFP-STK11重组质粒构建成功;在转染A549和H460细胞后24h观 察到绿色荧光最强;Western blot结果显示STK11蛋白在转染后24 h条带最深;划痕实验显示,转染组 细胞迁移距离小于0.9%氯化钠溶液对照组（P<0.05）。结论 成功构建STK11基因重组质粒,并能转 染A549和H460细胞,转染后对肺癌细胞迁移能力起一定抑制作用。     

膜-细胞骨架联接分子ezrin shRNA 真核表达载体的构建

 目的 构建膜-细胞骨架联接分子(ezrin)特异的RNA干扰质粒载体。 方法 设计转录短发夹状RNA (short hairpin RNAs, shRNA)的DNA 序列,与pSUPER质粒载体连接; 将构建成功的特异性表达载体(pSUPER-ezrin)转染至人乳腺癌MCF-7细胞系,并应用RT-PCR和Western blot检测ezrin的表达。 结果 与MCF-7细胞和转染空白质粒pSUPER细胞相比,转染pSUPER-ezrin表达载体的MCF-7细胞ezrin mRNA和蛋白的表达明显降低。 结论 构建的ezrin特异性shRNA表达载体可有效地沉默ezrin基因,为进一步研究ezrin表达对乳腺癌转移的影响奠定了基础。     

小分子蛋白慢病毒表达系统的构建

目的构建趋化因子蛋白慢病毒表达系统，建立稳定表达GFP的卵巢癌细胞系，为研究趋化因子蛋白的功能及作用机制打下基础。方法趋化因子CCL18、IL-8、CXCL1基因克隆质粒经PCR扩增、酶切，与慢病毒载体PWPI连接，构建的重组慢病毒质粒按比例与包膜质粒PCMV—dR8．74及包装质粒PMD2．G混合，LipofectinTM2000共转染293T细胞系包装病毒颗粒，病毒液感染卵巢癌SKOV3细胞后，采用流式细胞仪分选出GFP表达的细胞作为转染成功的细胞。实时荧光定量PCR验证转染后目的基因的表达，Westernblot验证目的蛋白的表达。结果重组慢病毒基因能高效地转导入靶细胞，转导效率达95％以上，并稳定表达；实时荧光定量PCR检测结果显示：细胞和组织中转染目的基因组与对照组比较，均见目的基因的表达显著：噌高（P〈0．05）；Westernblot验证转染目的基因组小分子蛋白成功表达。结论本实验成功构建了小分子蛋白慢病毒表达系统，为进一步研究小分子蛋白在人体的功能及作用机制建立了实验基础。     

放射诱导的一氧化氮同步放大基因电路的构建及鉴定

背景与目的 正反馈基因电路（genecircuits）对基因表达有放大作用，目的 基因在细胞内的同步化表达可进一步增强基因治疗效果。本研究旨在构建由放射诱导的一氧化氮（nitric oxide，NO）同步放大基因电路，以探索提高目的基因表达水平、延长表达时间的新途径，从而进一步完善肿瘤放射基因治疗模式。方法 将具有放射诱导性的c-fos启动子与诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）串联，构建c-fos启动子驱动的iNOS和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）双顺反子表达载体pros-iNOS／GFP；用脂质体介导该载体转染肺腺癌A549细胞，予以一定剂量照射，观察照射后不同时相点细胞荧光强度，检测iNOS蛋白表达水平。结果转染载体pros-iNOS／GFP的细胞照射后细胞荧光强度、iNOS表达水平均较对照组明显增加，其中以照射后16h增加最为明显。结论成功构建了放射诱导的NO同步放大基因电路，大大提高了放射诱导的目的基因的表达水平，为进一步提高肿瘤放射基因治疗的疗效奠定了理论基础。     

Smad2小干扰RNA载体的构建及其沉默效应的鉴定

目的构建smad2特异性小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并检测肿瘤细胞中其对smad2基因表达的干扰效果。方法根据smad2基因序列设计合理的smad2 siRNA,并将合成的寡核苷酸序列克隆到pSliencer 2.1-U6 neo载体中,转化大肠杆菌DH5α;挑取阳性菌落进行质粒酶切和序列分析;将构建正确的smad2 siRNA重组质粒转染,或与带Flag标签的smads真核表达载体共同转染293T细胞或HeLa细胞,收集细胞裂解物,Westem印迹检测siRNA的干扰效果。结果正确构建了smad2 siRNA重组质粒,对smad2表达的特异性干扰效果可达70%以上。结论成功构建了smad2 siRNA载体,为进一步探讨smad2在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

[目的]构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。[方法]针对cyclin E基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclin E shRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。[结果]酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对cyclin E的shRNA表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。[结论]成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因治疗的研究提供实验基础。