鸡新城疫免疫胶体金诊断技术的研究

为了建立一种快速、简便的检测鸡新城疫病毒(NDV)的胶体金免疫层析法(GICA),采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的ND抗体,并包被在玻璃纤维素膜上,另外将纯化的ND抗体和纯化的兔抗鸡抗体包被在硝酸纤维素膜上,组装成ND快速检测试纸条.用本试验研制的ND快速检测试纸条检测收集的24份样品,其结果与HA结果一致,符合率100%;当病毒HA效价在1∶40以上时,试纸条均能检测为阳性;ND快速检测试纸条与已知的马立克病(MD)病料和鸡传染性法氏囊病(IBD)病料的上清液无交叉反应出现,且保存6个月后重复性100%.试验证明,建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的抗原检测方法,可用于鸡新城疫诊断,具有广泛应用价值.     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

猪瘟胶体金免疫层析快速诊断法的建立及应用

运用胶体金免疫层析技术,建立一种操作简单、灵敏度高、特异性好,能区分强弱毒感染,适合临床诊断的检测猪瘟病毒的方法。本试验利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白作为弱毒抗原,利用PK15细胞培养纯化后的猪瘟病毒强毒用作强毒抗原,研制了胶体金免疫层析猪瘟病毒抗体检测试纸条。结果显示,经过37℃破坏,该试验方法制备的试纸条仍具有很好的稳定性;与间接血凝法、美国IDEXX酶免试剂比较,发现该试纸条灵敏度在一定程度上优于前者;用多种病毒、病原菌阳性血清考核,显示该试纸条亦具有较高特异性。该试纸条的研制为猪瘟的快速诊断提供了一种更加实用的方法。     

金标法与ELASA检测3种猪病的对比试验

正1检测卡的原理检测卡利用抗体快速金标检测卡法(简称金标法)检测抗体效价。金标法是在酶联免疫吸附法的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其检测原理是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用,标本中的抗体与胶体金结合的抗原相结合,再通过与膜上包被的抗原结合显色而达到检测目的。金标法的试剂为试纸条形式,即为金标试纸条。判定标准:猪瘟、口蹄疫抗体阳性≥1:32(5log2),蓝耳抗体阳性≥1:40;猪瘟、口蹄疫抗体阴性1:32(5log2),蓝耳抗体阴性1:40。     

基于p72蛋白的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸研制

为了研制灵敏、准确、特异及稳定的非洲猪瘟抗体快速检测试纸产品,以非洲猪瘟病毒（ASFV）p72蛋白为检测抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）为拦截线,对比重组蛋白p72的不同状态对试纸检测性能影响,优化标记条件、喷膜浓度、样品垫缓冲体系及成分、显色时间等因素,确定ASFV抗体检测试纸产品化的具体参数,并对试纸的特异性、均一性、准确性及稳定性进行鉴定。结果显示,试纸的检测敏感性为1∶51 200,优于商业化ASFV检测试剂盒,与其他猪源病毒阳性血清无交叉反应,变异系数小于10%,在临床样本检测中未见假阴性及假阳性结果,具有良好的敏感性、特异性、均一性及准确性;经加速稳定试验验证,可以室温保存1 a以上;与进口商品化试剂盒的总符合率为91.6%。综上,成功研制了ASFV抗体检测试纸,且试纸的检测性能良好,可以用于ASFV抗体的快速筛查。     

两种检测水貂阿留申病毒抗体方法敏感性的比较研究

本研究对胶体金试纸条检测法与对流免疫电泳检测法检测水貂阿留申病毒抗体的敏感性进行对比研究。试验采用实验室制备的检验合格的试纸条,分别对20份不同效价的水貂阿留申病毒阳性质控血清和100份自然感染的田间血清进行检测,分析不同稀释度的阳性血清检出数量和阳性检出率,从而对两种检测方法的敏感性进行评估。结果显示,阳性质控血清在1∶64倍以下稀释时,试纸条对阳性血清和弱阳性血清的检出率均为100%,对100份自然感染阳性血清检出率为96%,表明该试纸条的检测具有较高的敏感性。     

胶体金免疫层析法检测猪旋毛虫病试验

用胶体金免疫层析试纸条检测10份猪旋毛虫病阳性样品,结果均为阳性;检测18份猪蛔虫病、12份猪囊虫病、11份猪细颈囊尾蚴病阳性样品和10份健康猪阴性样品,结果全部呈阴性;检测6份人工感染猪旋毛虫病阳性血清抗体滴度,结果与ELISA方法相一致。用该试纸条诊断旋毛虫病,特异性高,敏感性强,重复性和稳定性好,方法简便,快速实用。     

以二抗为基底猪瘟抗体ELISA检测方法建立

为验证以鼠抗猪IgG为基底,用辣根过氧化物酶标记猪瘟E2蛋白,建立的猪瘟抗体ELISA检测方法的可行性,对影响ELISA试验结果的主要条件进行优化。结果表明,鼠抗猪IgG最佳包被浓度为1μg/ml,酶标猪瘟E2蛋白最佳稀释度为1:500,最佳封闭液为1%BSA。建立的方法对猪蓝耳病阳性血清、猪圆环病阳性血清、猪亚洲1型口蹄疫阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清均无交叉反应。通过对50份试验样本的检测,对比该方法与商品化IDEXX的猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性,试验结果表明,该方法检测猪瘟抗体的相对敏感性为76.9%(30/39),相对特异性为90%(45/50)。     

免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗

试验选取自身蛋白制备克盐酸伦特罗克伦特罗载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的检测试纸条。通过检测试纸条敏感性、保存期、金标抗体工作浓度选择、操作方法对比、实验检测及与单抗金标试纸条平行检测等试验,证明建立的免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗具有实用性、可靠性和稳定性。自身全血清作载体可使抗盐酸克伦特罗的ELISA效价高达4万以上。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng·mL-1,试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。市售单抗金标试纸条检测结果与ELISA法的阳性符合率为95%(19/20)。     

应用B.melitensis 16M单克隆抗体建立羊布病的胶体金免疫层析检测体系

[目的]用B.melitensis16M提纯的LPS和O链抗原作为检测抗原,研制出针对B.melitensis16M的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断布病的胶体金免疫层析方法。[方法]B.melitensis16M全菌免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定免疫球蛋白亚类及亲和力。用HiTrapProteinGHP亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法。选择最佳反应模式组装成试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性、阳性病料试验。[结果]筛选出能稳定分泌抗B.melitensis16M的种特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株2D10、3C6、1E10,单抗亚类分别为IgG2a、IgG1,亲和常数(k)介于1×10-8￣2.6×10-10。根据配对实验,以3C6为最佳包被抗体,2D10为最佳金标抗体。抗体IgG标记浓度为30μg/ml时,检测效果最佳。同时,与B.melitensis16M多抗IgG作为包被抗体、2D10为金标抗体的检测体系对比,两种包被方法组装的试纸条最低检出量为5.0×103CFU/ml,且不与其它菌发生交叉反应,保持期≥100d。以荧光定量PCR为参照,试纸条检测80份阳性病料,检检出率为100%。[结论]建立的胶体金免疫层析方法检测B.melitensis16M快速、简便、可靠,有望开发成为布病快速诊断试剂盒。     

O型口蹄疫单克隆抗体6H4株金标试纸条的制备

以制备的O型口蹄疫单克隆抗体为基础,结合免疫金技术,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,对6H4单克隆抗体进行标记,制备了该单克隆抗体的金标试纸条.研究结果表明,6H4单克隆抗体在pH 8.64下的稳定点为12 mg/L,可制备成金标记抗体及其反应膜.     

水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析技术的研究

[目的]制备一种特异、快速、便捷的检测虾及鱼肉中恩诺沙星残留的胶体金免疫层析试纸条。[方法]用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体,喷于试纸的金标垫。将ENR-OVA(恩诺沙星和卵清白蛋白的偶联物)和纯化的羊抗兔IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(质控线)处,通过挑选试纸条材料和调试工艺参数,并最终组装成试纸条。[结果]制备的试纸条检测体系方法的检出限为0.9 ng/ml。试纸条对虾及鱼肉中的恩诺沙星残留的检出限分别为5和10 ng/g。[结论]制备的恩诺沙星胶体金检测试纸适用于现场实际样品恩诺沙星残留水平检测,具有良好的应用前景。     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

2个厂家不同剂量猪瘟疫苗临床免疫效果比较

【目的】比较2个厂家不同剂量猪瘟疫苗的临床免疫效果。【方法】将60头断奶空怀母猪随机平均分为2组,一组接种较高剂量猪瘟疫苗E(E组),另一组接种较低剂量猪瘟疫苗A(A组);当母猪产仔后,所产仔猪在20d与60d时分别接种1次;采集不同阶段的母猪、仔猪与生长猪的血清,用阻断ELISA方法检测猪瘟病毒抗体。【结果】在断奶空怀母猪阶段,两组之间无差异。在其他阶段,E组猪瘟病毒抗体阻断率一直高于A组,各个阶段均达到显著(P0.05)水平;除35d与56d仔猪外,E组猪瘟病毒抗体阻断率变异系数都小于A组;E组猪瘟病毒抗体阳性率都高于A组,其中在35d仔猪达到显著水平。抗体检测结果显示,E组猪瘟免疫抗体数据优于A组,表明猪瘟疫苗E的临床免疫效果优于疫苗A。【结论】较高剂量猪瘟疫苗的临床免疫效果好于较低剂量疫苗,为剂量存在差异的不同厂家猪瘟疫苗的临床选用提供了试验依据。     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95.56%;间接血凝试验结果效价在1∶16以上(含1∶16)的血清样品为88份,占总样品比例的97.78%,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。     

Efficient purification of cell culture-derived classical swine fever virus by ultrafiltration and size-exclusion chromatography

Large-scale production of cell culture-based classical swine fever virus (CSFV) vaccine is hampered by the adverse reactions caused by contaminants from host cell and culture medium. Hence, we have developed an efficient method for purifying CSFV from cell-culture medium. Pure viral particles were obtained with two steps of tangential-flow filtration (TFF) and size-exclusion chromatography (SEC), and were compared with particles from ultracentrifugation by transmission electron microscopy (TEM), infectivity and recovery test, and real time fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR). TFF concentrated the virus particles effectively with a retention rate of 98.5%, and 86.2% of viral particles were obtained from the ultrafiltration retentate through a Sepharose 4 F F column on a biological liquid chromatography system. CSFV purified by TFF-SEC or ultracentrifugation were both biologically active from 1.0×10^−4.25 TCID₅₀·mL⁻¹ to 3.0×10^−6.25 TCID₅₀·mL⁻¹, but the combination of TFF and SEC produced more pure virus particles than by ultracentrifugation alone. In addition, pure CSFV particles with the expected diameter of 40–60 nm were roughly spherical without any visible contamination. Mice immunized with CSFV purified by TFF-SEC produced higher antibody levels compared with immunization with ultracentrifugation-purified CSFV (P<0.05). The purification procedures in this study are reliable technically and feasible for purification of large volumes of viruses.     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95．56％;间接血凝试验结果效价在1：16以上（含1：16）的血清样品为88份,占总样品比例的97．78％,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。     

同时检测AFB_1和ZEA免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,将其与抗AFB1和ZEA单克隆抗体进行偶联,并把偶联物、AFB1-STI、ZEA-OVA以及硝酸纤维素膜(NC膜)等组装成免疫层析试纸条,同时进行检测条件的最优化设计。胶体金偶联AFB1和ZEA抗体最适pH同为7.0,最适抗体浓度分别为5.0和2.5μg.mL-1,NC膜上包被AFB1-STI和ZEA-OVA的浓度分别1.0和2.0mg.mL-1,为该方法可同时定性检测样品中AFB1和ZEA,其最低检测限分别达到5μg.kg-1和50μg.kg-1;与黄曲霉毒素M1、脱氧血腐镰刀菌烯醇的交叉反应率小于1%。该试纸条具有可同时检测两种真菌毒素的特点,适用于同一样品中多种毒素的快速检测。     

河南省猪瘟流行情况调查

[目的]为了弄清河南省猪瘟的流行病学规律,研究猪瘟强毒株感染情况,查实规模化猪场猪瘟免疫情况。[方法]使用ELISA方法和革兰氏染色方法对301份病猪的样本进行猪瘟强毒抗原及细菌感染情况的检测,分析猪瘟在河南省猪群的感染、流行范围情况及同细菌病的混合感染情况;对猪瘟阳性猪场采取综合防治措施并对采取措施后没有效果的猪场进行了蓝耳病和圆环病毒病的检测,确定混合感染情况。[结果]猪瘟在河南省流行广泛;猪瘟病毒的平均检出率为26.25%;细菌感染占猪瘟病毒总阳性样本的25.31%;蓝耳病和圆环病毒病与猪瘟有不同程度的混合感染;综合性防治措施实施后对大部分猪厂效果明显;但对混合感染的猪群效果不好。[结论]猪瘟与细菌、蓝耳病、圆环病毒病等混合感染是造成猪瘟难以根治的主要原因;综合防治措施的实施是净化猪瘟的重要手段。