免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗

试验选取自身蛋白制备克盐酸伦特罗克伦特罗载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的检测试纸条。通过检测试纸条敏感性、保存期、金标抗体工作浓度选择、操作方法对比、实验检测及与单抗金标试纸条平行检测等试验,证明建立的免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗具有实用性、可靠性和稳定性。自身全血清作载体可使抗盐酸克伦特罗的ELISA效价高达4万以上。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng·mL-1,试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。市售单抗金标试纸条检测结果与ELISA法的阳性符合率为95%(19/20)。     

鸡新城疫免疫胶体金诊断技术的研究

为了建立一种快速、简便的检测鸡新城疫病毒(NDV)的胶体金免疫层析法(GICA),采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的ND抗体,并包被在玻璃纤维素膜上,另外将纯化的ND抗体和纯化的兔抗鸡抗体包被在硝酸纤维素膜上,组装成ND快速检测试纸条.用本试验研制的ND快速检测试纸条检测收集的24份样品,其结果与HA结果一致,符合率100%;当病毒HA效价在1∶40以上时,试纸条均能检测为阳性;ND快速检测试纸条与已知的马立克病(MD)病料和鸡传染性法氏囊病(IBD)病料的上清液无交叉反应出现,且保存6个月后重复性100%.试验证明,建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的抗原检测方法,可用于鸡新城疫诊断,具有广泛应用价值.     

猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制

采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,用猪瘟(CSF)抗体标记纯化,并包被在玻璃纤维膜上,另外将纯化的CSF抗体和羊抗鼠抗体包被在硝酸纤维膜上,组装成CSF快速检测条,对猪瘟病毒进行检测.结果表明:使用所研制的CSF快速检测条检测收集的70份待检样品,共检出猪瘟阳性病例26例,而经病毒分离鉴定阳性病例有28例,阳性符合率达92.8%;将5份阳性猪瘟病毒稀释后用试纸条和ELISA方法进行敏感性实验,结果表明,诊断试纸条的敏感性较高,用试纸条对鸽新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒进行检测,无交叉反应.     

猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的制备及其制备胶体金检测试纸条的应用

制备猫泛白细胞减少症病毒(FPV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条.用FPV临床分离株免疫Balb/c小鼠,取血凝抑制(HI)效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用HI方法筛选获得2株可稳定分泌FPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其用于胶体金检测试纸条进行评价.2株杂交瘤细胞3C3和4A1株,分泌的单克隆抗体重链亚型分别为IgG2b、IgG2a,轻链亚型均为kappa;腹水纯化后单克隆抗体3C3、4A1的HI效价分别为1:5120、1:10240.用胶体金标记单克隆抗体4A1,单克隆抗体3C3作为检测线,羊抗鼠二抗作为对照线制备的胶体金检测试纸条,检测FPV病毒液的灵敏度为103.7 TCID50/mL;检测猫源其他病毒如FHV-1、FCV均为阴性;批内和批间重复性检测不同含量的FPV结果一致;检测513份临床样品,与PCR的阳性符合率为76％(71/93),阴性符合率为100％(420/420),总符合率为96％(491/513).该研究制备的FPV单克隆抗体可用于FPV胶体金检测试纸条的生产,用于FPV的现场快速检测.     

泰州地区宠物弓形虫感染流行现状调查与防治

为调查泰州地区宠物犬猫弓形虫感染流行现状,随机采集泰州地区不同来源犬与猫的血液样本,采用弓形虫抗体ELISA试剂盒与弓形虫抗体胶体金试纸条2种方法对该地区犬猫弓形虫感染情况进行流行病学调查,并开展治疗试验。结果表明,该地区597份宠物血清样本经ELISA试剂盒与胶体金试纸条2种方法检测出的弓形虫抗体阳性率分别为12.06%(犬8.05%,猫19.34%)、11.60%(犬7.79%,猫18.40%);且农村散养犬和猪与流浪犬和猫的血清弓形虫抗体阳性率最高;成年犬和猫的弓形虫抗体阳性率明显高于幼年犬和猫;春季采集的犬和猫血清样本弓形虫抗体阳性率最高;阳性样本宠物主人血清弓形虫抗体阳性率为8.57%;对于具有临床症状的感染犬猫通过综合治疗措施,治愈率达81.82%。同时数据显示,ELISA试剂盒检测敏感性高于胶体金试纸条,但两者差异不显著。     

猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(△E2).PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-AE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组△E2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达.KCl预染切胶法纯化△E2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法.用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%.为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础.     

单抗标记检测新城疫病毒免疫胶体金试纸条的研制

利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒标记单克隆抗体4E8,用兔抗鼠二抗喷洒在硝酸纤维素膜上作为对照线,用另一株单抗5E6作为检测线,制备成胶体金试纸条。用试纸条检测120份泄殖腔样品,结果与病毒增殖后HA法测得的结果符合率为95.8%,HA效价在1∶2以上,试纸条均能检测为阳性,与其他病毒的阳性血清没有交叉反应,且室温下可有效保存6个月。试纸条应用方便、快速,适合临床推广以及流行病学调查。     

两种检测水貂阿留申病毒抗体方法敏感性的比较研究

本研究对胶体金试纸条检测法与对流免疫电泳检测法检测水貂阿留申病毒抗体的敏感性进行对比研究。试验采用实验室制备的检验合格的试纸条,分别对20份不同效价的水貂阿留申病毒阳性质控血清和100份自然感染的田间血清进行检测,分析不同稀释度的阳性血清检出数量和阳性检出率,从而对两种检测方法的敏感性进行评估。结果显示,阳性质控血清在1∶64倍以下稀释时,试纸条对阳性血清和弱阳性血清的检出率均为100%,对100份自然感染阳性血清检出率为96%,表明该试纸条的检测具有较高的敏感性。     

口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.     

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。     

链霉素快速检测试纸的研制及其性能测定

以分泌抗链霉素(SM)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株的建立为基础,应用胶体金免疫层析技术成功研制出SM残留快速检测试纸,并对其敏感性、特异性、重复性、符合性等特性进行了测定。结果表明,检测试纸的检测限为8μg/L;检测上线为100μg/L;与双氢链霉素的交叉反应为100%,与其他抗生素类药无交叉反应;其敏感性与ELISA试剂盒相当,与ELISA试剂盒的检测结果符合率为100%;检测试纸在10 min内显示结果。     

抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)单克隆抗体的制备及初步应用

制备抗沙眼衣原体(CT)单克隆抗体,建立沙眼衣原体的胶体金免疫层析快速检测方法。采用纯化沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)免疫Balb/c小鼠,选取高效价的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA检测筛选分泌抗MOMP单克隆抗体(McAb)的细胞株并进行相关鉴定。共获得分泌IgG1,IgG2b和IgM的3株单克隆抗体杂交瘤细胞株。纯化的单克隆抗体与鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。通过位点分析选择配对良好的两株McAb,制备检测CT的双抗体夹心法免疫层析试纸条。制备的胶体金试纸条对MOMP的最低检出值可达50 ng·mL-1。     

水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析技术的研究

[目的]制备一种特异、快速、便捷的检测虾及鱼肉中恩诺沙星残留的胶体金免疫层析试纸条。[方法]用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体,喷于试纸的金标垫。将ENR-OVA(恩诺沙星和卵清白蛋白的偶联物)和纯化的羊抗兔IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(质控线)处,通过挑选试纸条材料和调试工艺参数,并最终组装成试纸条。[结果]制备的试纸条检测体系方法的检出限为0.9 ng/ml。试纸条对虾及鱼肉中的恩诺沙星残留的检出限分别为5和10 ng/g。[结论]制备的恩诺沙星胶体金检测试纸适用于现场实际样品恩诺沙星残留水平检测,具有良好的应用前景。     

非洲猪瘟病毒无标签p35蛋白的制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80 000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10 000,阴性和阳性判定阈值OD₄₅₀为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的A...     

2种口蹄疫O型抗体阻断ELISA检测试剂盒应用比较

为评估2种常用口蹄疫O型抗体检测试剂盒的性能差异,对2020年春季随机抽检的3家规模养殖场提供的60份猪血清分别用液相阻断ELISA试剂盒和抗体阻断(固相)ELISA试剂盒进行了检测,并比较了2种试剂盒的阳性检出率和符合率。结果表明,2种方法检测结果总符合率为91.67%,符合程度高。在基层畜牧兽医部门日常定性检测中,推荐使用抗体阻断(固相)ELISA检测试剂盒。     

猪瘟病毒结构蛋白E0抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5 000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD_(450)0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%～7.69%和2.16%～9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。     

鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的 H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0-8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10³、1:10³、1:10⁵、1:10³。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。     

猪O型FMDV抗体检测试纸条与ELISA对比试验

为初步评价研制的猪O型FMDV抗体检测试纸条的性能,检测了免疫FMDV多肽疫苗20 d后制备的猪血清(143份),并对比FMDV VP1抗体检测ELISA试剂盒的检测结果。结果显示,二者的符合率为100%。猪O型FMDV抗体检测试纸条特异、敏感、快速、简便,具有广阔的推广应用前景。     

应用B.melitensis 16M单克隆抗体建立羊布病的胶体金免疫层析检测体系

[目的]用B.melitensis16M提纯的LPS和O链抗原作为检测抗原,研制出针对B.melitensis16M的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断布病的胶体金免疫层析方法。[方法]B.melitensis16M全菌免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定免疫球蛋白亚类及亲和力。用HiTrapProteinGHP亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法。选择最佳反应模式组装成试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性、阳性病料试验。[结果]筛选出能稳定分泌抗B.melitensis16M的种特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株2D10、3C6、1E10,单抗亚类分别为IgG2a、IgG1,亲和常数(k)介于1×10-8￣2.6×10-10。根据配对实验,以3C6为最佳包被抗体,2D10为最佳金标抗体。抗体IgG标记浓度为30μg/ml时,检测效果最佳。同时,与B.melitensis16M多抗IgG作为包被抗体、2D10为金标抗体的检测体系对比,两种包被方法组装的试纸条最低检出量为5.0×103CFU/ml,且不与其它菌发生交叉反应,保持期≥100d。以荧光定量PCR为参照,试纸条检测80份阳性病料,检检出率为100%。[结论]建立的胶体金免疫层析方法检测B.melitensis16M快速、简便、可靠,有望开发成为布病快速诊断试剂盒。     

莴苣花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

为建立莴苣花叶病毒的现场快速检测方法,采用胶体金标记莴苣花叶病毒的兔多克隆抗体,在硝酸纤维素膜上喷涂检测T线和质控C线,制作胶体金免疫层析试纸条。该试纸条检测莴苣花叶病毒提纯病毒的灵敏度为1μg·mL-1,检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍(重量/体积)。试纸条可特异性检测到莴苣花叶病毒的3个分离物,与马铃薯X等8种病毒无交叉反应。田间采集的莴苣样品试纸条和酶联检测的结果一致。该试纸条适用于疑似莴苣花叶病毒感染的莴苣叶片的快速诊断,并在10min内获得检测结果。