流感病毒核酸检测能力考核结果分析

目的:参加流感病毒核酸检测能力考核,比对实验结果,找出问题。方法:用RT-PCR方法检测季节性流感A型、H1亚型、H3亚型、B型病毒核酸,用real-time PCR方法检测甲型H1N1病毒核酸。根据反馈结果,RT-PCR方法检测阴性的样品用real-time PCR方法重新检测。结果:根据国家流感中心反馈结果,10份盲样中9份分别准确检测到了相应的病毒核酸;1号盲样RT-PCR方法检测阴性,用real-time PCR方法复检为B型流感病毒核酸阳性,表明real-time PCR方法具有更高的灵敏度。结论:real-time PCR方法具有灵敏性高、特异性高、重复性好等优点,适用于流感疫情的快速检测诊断。     

分子生物学方法在儿童流行性感冒监测中的应用

目的：建立一种能够快速，特异，有效地直接从临床标本中检测流行感冒（流感）病毒并进行病毒型和亚型鉴别的方法，同时了解近年来北京地区A3型流感病毒因凝素重链（HA1）区基因的变异特点。方法：根据编码A、B型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物，用于同一逆转录（RT）－PCR反应中（多重RT－PCR），根据A、B型毒株扩增产物的大小（分别为506bp和261bp）鉴别A、B型流感病毒，另根据编码A1和A3型流感病毒糖蛋白HA基因的核苷酸序列设计两对引物，与B型M基因基因引物用同一RT－PCR反应中，可区分A1、A3或B型病毒HA基因和B型病毒M基因又设计了3对引物作为外侧引物，进行巢式－PCR反应。根据第二次PCR的扩增产物在1．2％的琼脂糖凝胶电泳中的大小即可确定型别。经PCR扩增1996－2002年间分离的北京地区A3型流感病毒株HA1区基因，测序并进行序列分析，结果：用上述多重RT－PCR鉴定流感病毒分离株156株，与血凝抑制试验阳性符合率为100％，用多重巢式－PCR检测92份已经病毒分离确定为流感的儿科临床呼吸道标本，与病毒分离和血凝抑制试验阳性符合率分别为76．9％（A1型）、57．1％（A3型）、86．5％（B型），对5株1996－2002年间A3间分离株HA1区基因序列分析结果显示，不同年份的分离株HA1区基因具有较高的核苷酸和氨基酸同源性，而且年份越近的毒株之间同生越测。为流感监测提供更加快速的新方法，北京地区A3型流感毒分离株HA1区基因持续不断地发生点突变，糖基化位点不断增多，可能是导致其抗原漂移的原因。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的：建立双重荧光定量RT—PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒，并应用于临床样本的检测。方法：在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针，建立优化单一和双重荧光RT—PCR反应体系，评价所建双重RT—PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果：该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性，检出限分别为0．1TCID50和0．01TCID50，可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0．998和0．999，具有较好的稳定性。结论：本研究建立的双重荧光定量RT—PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒，灵敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。     

real-time PCR 在流感哨点监测中的应用效果观察

目的分析研究real-time PCR在流感哨点监测中的应用效果和实际作用,进一步提高流感监测的工作效率。方法按照2017版《全国流感监测方案》,收到哨点医院流感样病例标本后,在2个工作日内利用real-time PCR进行流感病毒亚型或系鉴定,对于检测结果阳性的标本,1周内利用状态良好的MDCK细胞进行病毒分离,检测结果在检测完成后48 h内录入"中国流感监测信息系统"。结果全年共分离流感毒株373株,病毒分离率为17.36%;分离的三类流感病毒H1N1型、B型、H3N2型的分离率分别为93.83%、76.49%、49.07%,三类流感病毒分离率比较,差异有统计学意义(χ~2=61.99,P0.01);3种类型的流感毒株滴度构成进行比较,差异有统计学意义(χ~2=180,P0.01)。其中H3N2的毒株主要集中在1:8滴度。结论在流感哨点监测中,应用real-time PCR进行初筛分型,可以提高病毒分离率,及时发现病毒变异株,更加有效地防控流感疫情。     

2012-2014年安康市流感病毒分离结果及分析

目的对安康市2012-2014年流行期流感病毒进行分离鉴定及分析,了解安康市流感流行动态,探索流行规律。方法采集流感样病例(ILI)的咽拭子标本先用real-time PCR检测,阳性标本用狗肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2012年10月至2014年3月共监测1所哨点医院ILI咽拭子标本905份,其中PCR阳性171份;分离出流感病毒97株,其中新甲型H1N1 62株,季节性A(H3N2)11株,B型(yamagata)24株。结论 2012-2014年流感流行季节中安康市流行的优势毒株为新甲型H1N1,12月至次年1月为流行高峰,有其他型别的交替流行。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

应用多重PCR技术快速检测临床标本中常见呼吸道病毒

[目的]应用多重PCR技术快速检测流感样病例和不明原因肺炎病例呼吸道标本中的常见呼吸道病毒,为急性病毒性呼吸道感染的监测和应急处理提供快速诊断手段。[方法]提取标本中病毒核酸RNA/DNA,反转录合成cDNA,多重PCR扩增目的基因,电泳检测扩增产物。[结果]从30份呼吸道标本中检出甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒A型。[结论]本研究初步验证了该多重PCR技术能用于快速检测流感样病例和不明原因肺炎病例呼吸道标本中的常见呼吸道病毒。     

云浮市流感病原学监测

目的分析2011年-2013年云浮市流行性感冒(流感)的流行特征,并了解云浮市动物市场外环境中高致病性禽流感病毒的分布情况,为科学防控流感提供依据。方法每周采集监测哨点医院、学校流感样患者的鼻咽拭子标本,采用real-time PCR检测流感病毒核酸,PCR阳性咽拭标本同时采用鸡胚和MDCK细胞分离病毒;同时采用real-time PCR法对活禽市场外环境标本进行禽流感病毒核酸检测。结果 2011年-2013年共检测流感样病例标本5 673份,阳性295例,阳性率为5.20%。2011年-2013年流感流行高峰为当年12月和(或)次年1月-3月。A(H1N1)pdm09型、B型(Victoria)、A(H3N2)和B型(Yamagata)顺序交替成为云浮市2011年-2013年的优势毒株。0岁~15岁少年儿童阳性检出率相对较高。外环境中主要存在H5和H9禽流感病毒。结论云浮地区流感病毒流行较集中于冬春季,循环优势株变化频繁。应加强监测,及时发现病毒的变异情况;同时加强流感的预防接种等有效预防措施,以减少流感流行造成的疾病负担。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT—PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法。方法 设计合成LNA探针，替代MGB探针，建立一步法TaqManRT—PCR方法，并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化；用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA。以优化的TaqManRT—PCR方法进行检测，比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性。结果 LNA探针TaqMan RT—PCR有较好的PCR扩增效率（104％）、较广的线性范围（10^0-10^-7样品稀释度）、较高的敏感性（0．003TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于4．53％），新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性（0.03TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于6．36％）。结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT—PCR反应。简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT—PCR可满足登革病毒快速检测的需要。     

TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革Ⅰ型病毒

目的检测发热患者血清中的登革病毒含量,并判定其型别。方法在登革病毒的E基因区设计一对引物和一条MGB探针,建立TaqMan MGB实时荧光定量PCR体系;从10份疑似登革热患者血清中提取病毒RNA,逆转录成cDNA,采用TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术检测登革病毒及其型别。结果10份血清样本中,有9例出现阳性扩增曲线,病毒含量在103-105拷贝/ml,且扩增产物均出现大约100 bp的扩增带。结论2006年在广州市流行的登革热是由登革Ⅰ型病毒引起,TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革病毒感染具有快速、敏感的特点,为登革热的早期诊断提供了可能。     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

新型冠状病毒双重荧光RT-PCR检测方法

目的为快速检测新型冠状病毒,防控疫情的输入,建立一种快速的双重实时荧光RT-PCR检测方法。方法对WHO公布的单重实时荧光RT-PCR检测引物和探针进行重新设计和优化,建立双重荧光RT-PCR反应体系,分别采用羧基荧光素(FAM)和绿色荧光蛋白(VIC)荧光基团标记探针,实现双基因的同时检测。结果经优化的双重实时荧光RT-PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒检测灵敏度为31拷贝/μl,检测健康和普通发热人员咽拭子以及流感病毒无交叉反应。结论建立了双重实时荧光RT-PCR快速检测方法,提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于新型冠状病毒的快速应急检测。     

荧光定量RT-PCR在快速检测流感病毒A型和B型上的应用研究

[目的]探讨荧光定量RT-PCR在流感病毒快速检测上的意义。[方法]收集疑似流感样本20例,分别用定量RT-PCR技术和鸡胚分离培养方法进行检测。[结果]26份标本中定量RT-PCR检测阳性率为57.7%（15/26）,鸡胚分离培养检测的阳性率为26.9%（7/26）。两者的阳性率有统计学差异。[结论]荧光定量RT-PCR方法在检测流感病毒方面具有快速、操作方便、特异性强、灵敏度高优点。因此可以作为一种快速流感病毒检测的诊断方法。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。