三七总皂苷对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的研究

目的 探讨三七总皂苷(PNS)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响及机制.方法 体外培养人HK-2细胞并分为3组:正常对照组(含5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(含25 mmol/L D-葡萄糖)和高糖+PNS组;48h后细胞免疫化学方法测定各组HK-2细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),用ELISA法检测细胞培养上清中纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)和细胞转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达.结果 对照组HK-2细胞形态为立方形铺路石样,未见α-SMA阳性表达;高糖组细胞变为梭形长条样,α-SMA的表达也明显增多(P＜0.05);治疗组细胞大部分仍呈立方形铺路石样,α-SMA的表达明显下降(P＜0.05).高糖组TGF-β1与FN浓度显著高于对照组(均P＜0.01),治疗组TGF-β11与FN的表达明显低于高糖组(均P＜0.01).α-SMA的表达与TGF-β1、FN的表达呈正相关.结论 PNS可能通过抑制肾小管上皮细胞α-SMA的表达和细胞外基质分泌,从而抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,对糖尿病肾病有一定防治作用.     

参地补肾胶囊对高糖培养的肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表达的影响

目的:观察参地补肾胶囊对高糖培养下肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA表达的影响,探讨参地补肾胶囊抗肾间质纤维化的作用机制。方法:以高糖培养的人肾小管上皮细胞作为研究对象,采用血清药理学研究方法和Real-time PCR检测技术,观察空白对照组、高糖模型组、参地补肾胶囊组和贝那普利组的TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA的表达,采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。结果:高糖培养下的人肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA mRNA的表达与空白对照组比较明显增加(P0.05),E-cadherin mRNA的表达与空白对照组比较明显降低(P0.05);参地补肾胶囊组能够下调肾小管上皮细胞对TGF-β1、α-SMA mRNA的表达,上调E-cadherin mRNA的表达,与高糖模型组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:本研究表明参地补肾胶囊通过下调高糖刺激的人肾小管上皮细胞对TGF-β1、α-SMA mRNA的异常表达,上调E-cadherin mRNA的异常表达,从而发挥抗肾间质纤维化的作用。     

糖肾1号方含药血清对高糖环境下培养的HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FNmRNA和蛋白水平的影响

[目的]观察糖肾1号方含药血清干预高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白水平,初步探索糖肾1号方治疗糖尿病肾病可能的作用机制。[方法]选用HK-2细胞,分为空白组、高糖组、空白血清组、糖肾1号方含药血清低剂量组、糖肾1号方含药血清高剂量组。高糖环境下培养24 h后,进行血清干预24 h,培养48 h后收集细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平。[结果]1)与空白组相比,高糖组的TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P0.05)。2)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组、糖肾1号方高剂量组TGF-β1、α-SMA、FN mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05)。3)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05),糖肾1号方高剂量组α-SMA、FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P0.05)。4)与糖肾1号方低剂量组相比,糖肾1号方高剂量组TGF-β1、FN mRNA降低,差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]糖肾1号方含药血清可抑制TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和α-SMA、FN蛋白表达水平,糖肾1号方高剂量组效果优于糖肾1号方低剂量组。     

补肾化瘀泄浊方通过调控细胞外调节蛋白激酶信号通路阻抑人肾小管上皮细胞间充质转化的机制研究

目的:观察补肾化瘀泄浊方对转化生长因子(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)的上皮间充质转化(EMT)及Smad2/3的影响,探讨其阻抑HK-2 EMT的机制。方法:采用TGF-β1诱导建立HK-2 EMT模型,Western blot检测TGF-β1对EMT标记蛋白、Smad2/3及细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号蛋白的影响。予不同剂量补肾化瘀泄浊方进行干预,Real-Time PCR检测EMT相关基因mRNA的表达,Western blot检测EMT相关蛋白、Smad2/3及ERK的表达;与ERK通路抑制剂PD98059作比较,观察补肾化瘀泄浊方通过ERK信号通路干预HK-2 EMT的作用。结果:与空白组比较,模型组HK-2细胞出现EMT特有的“纺锤形”结构,EMT标记α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),E-cadherin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),且磷酸化ERK及Smad2/3蛋白水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,补肾化瘀泄浊方各剂量组HK-2细胞EMT样形态改善,α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),磷酸化ERK及Smad2/3蛋白水平下降(P<0.05),且剂量越高作用越明显。与模型组比较,ERK通路抑制剂能显著下调α-SMA、Vimentin、磷酸化Smad2/3蛋白水平(P<0.05);补肾化瘀泄浊方高剂量具有与ERK通路抑制剂类似的作用。结论:TGF-β1可诱导HK-2 EMT,上调ERK及Smad2/3磷酸化水平,补肾化瘀泄浊方很可能通过抑制ERK通路活化,下调Smad2/3磷酸化水平,阻抑HK-2 EMT。     

肾复康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞HK-2纤维化模型的影响及其机制研究

目的:探讨肾复康含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞株HK-2间质转化的影响及其分子机制。方法:以HK-2细胞作为研究对象,常规培养后将细胞进行如下分组及刺激处理:空白对照组、模型对照组(10 ng/ml TGF-β1刺激)、32 g/kg尿毒清30%含药血清组(30%尿毒清含药血清+TGF-β1刺激)、18.32 g/kg肾复康10%、30%含药血清组(10%或30%肾复康含药血清+TGF-β1刺激)。MTT法检测肾复康含药血清对HK-2细胞活力的影响;显微镜下观察各组细胞间形态学的差异;ELISA法检测各组细胞上清液中I型胶原(collagen I)和纤维连接蛋白(fibronectin)的水平;q-PCR法检测各组细胞内E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形纤维蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和整联蛋白连接激酶(ILK)基因的表达水平;蛋白免疫印迹法检测Smad2/3总蛋白、核蛋白表达及其磷酸化水平;蛋白免疫印迹法检测下游的ILK蛋白表达水平。结果:肾复康含药血清对HK-2细胞的存活率无抑制作用;与空白对照组比较,模型对照组细胞形态由上皮样的铺路石状变成间质样的长梭形,E-cadherin的mRNA水平显著下调(P0.01),Vimentin、α-SMA和ILK的mRNA水平显著上调(P0.01),Smad2/3的蛋白磷酸化及核内水平显著上调(P0.01);与模型对照组比较,肾复康各含药血清组E-cadherin的mRNA水平显著上调(P0.01),Vimentin、α-SMA和ILK的mRNA水平显著下调(P0.05或P0.01),Smad2/3的蛋白磷酸化及核内水平明显下调(P0.05或P0.01)。结论:肾复康能逆转TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞HK-2纤维化模型的上皮间质转化,其作用机制可能与其抑制胞内Smad2/3-ILK信号通路的活化有关。     

茶多糖对高糖诱导下HK-2细胞氧化应激损伤的保护作用及TGF-β_1、α-SMA表达的影响

目的:研究茶多糖(TPS)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)的氧化应激损伤的保护作用及其机制,探讨茶多糖对高糖诱导下HK-2细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。方法:DCFH-DA(组织活性氧荧光定量)法检测茶多糖对高糖刺激下HK-2细胞内活性氧(ROS)水平的影响。RTPCR检测TGF-β1、α-SMA m RNA的表达。Western-blot检测核因子NF-E2相关因子(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)、TGF-β1、α-SMA蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,高糖组ROS水平显著升高,经茶多糖干预后,ROS水平显著降低,其作用呈浓度依赖性;与正常对照组比较,高糖组Nrf2、HO-1蛋白表达均显著升高,经茶多糖干预后,与高糖组比较,Nrf2、HO-1蛋白表达均显著升高;与正常对照组比较,高糖组TGF-β1、α-SMA m RNA和蛋白表达均显著升高,经茶多糖干预后,TGF-β1、α-SMA m RNA和蛋白表达均显著降低。结论:茶多糖能减少高糖诱导的氧化应激损伤,其机制与激活Nrf2/ARE途径有关。茶多糖能降低TGF-β1和α-SMA的表达,减少高糖诱导下HK-2细胞EMT的发生。     

栀子苷对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中TGF-β/Smad通路的影响

[目的] 探究栀子苷（GE）对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中转化生长因子-β和Smad相关蛋白（TGF-β/Smad）通路的影响。[方法] 实验分为对照组、高糖组、GE 1、10、50、100 μmol/L组。对照组HK2细胞在5.5 mmol/L低糖DMEM培养液中培养,除对照组外,其余各组均于25 mmol/L高糖DMEM培养液中培养,GE 1、10、50、100 μmol/L组同时添加GE,使GE终浓度分别为1、10、50、100 μmol/L,干预48 h。显微镜下观察HK2细胞形态;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中纤连蛋白（FN）、E-钙黏素（E-cad）、Ⅳ型胶原（COLⅣ）mRNA水平;酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad3、磷酸化Smad3 （p-Smad3）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白水平。[结果] 对照组细胞呈多边形或卵圆形,分布均匀;高糖组细胞部分呈现长梭形、胞核呈梭形变;随着GE剂量的升高,细胞形态逐渐恢复正常。与对照组相比,高糖组细胞中FN、COLⅣ mRNA水平,TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA蛋白水平,上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高,细胞中E-cad mRNA水平降低（P＜0.05）;与高糖组相比,GE 1 μmol/L组细胞中FN mRNA水平,TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA蛋白水平,上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）,GE 10、50、100 μmol/L组细胞中FN、COLⅣ mRNA水平,TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA蛋白水平,上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,细胞中E-cad mRNA水平升高（P＜0.05）。[结论] GE可以抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中TGF-β/Smad通路。     

化瘀降浊汤对转化生长因子-β1/母系同源物家族信号通路相关蛋白的影响

目的观察化瘀降浊汤对转化生长因子(TGF)-β1诱导HK-2细胞发生上皮间质转分化(EMT)过程TGF-β/母系同源物家族Smad通路中关键因子E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Smad3、蜗形蛋白(Snail)的影响,探讨其保护肾功能的作用机制。方法 MTT法测定不同浓度化瘀降浊汤对TGF-β1诱导HK-2的细胞增殖抑制率,计算半数抑制率(IC50)。Western blot和RT-PCR检测E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和基因表达,间接免疫荧光检测E-cadherin蛋白表达。结果化瘀降浊汤在一定浓度范围内抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖,呈现出一定的量效关系,IC_(50)为472.017μg/m L。Western blot和RT-PCR检测结果显示,化瘀降浊汤中、高剂量组E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和m RNA表达与诱导组比较,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);免疫荧光检测结果显示,化瘀降浊汤能促进E-cadherin蛋白表达,与Western blot分析结果一致。结论化瘀降浊汤可能通过调节HK-2细胞TGF-β/Smad信号途径中的关键蛋白达到抑制甚至逆转肾小管EMT,从而对肾小管间质纤维化起到保护作用。     

三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究三七皂苷(PNS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的大鼠肾小管细胞上皮-间充质转化(EMT)的干预作用,并从沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/TGF-β_1/Smad通路分析其可能机制。方法:在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常组,TGF-β_1组(5μg·L~(-1)),白藜芦醇组(50 mg·L~(-1)),SIRT1阻断剂EX527组(10μmol·L~(-1)),PNS组(100 mg·L~(-1)),EX527+PNS组(EX527 10μmol·L~(-1),PNS 100 mg·L~(-1)),48 h后收集细胞;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测SIRT1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙黏附蛋白(E-cadherin),TGF-β_1,Smad3,Smad4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1,α-SMA,E-cadherin,TGF-β_1蛋白表达。结果:与正常组比较,TGF-β_1组α-SMA mRNA及蛋白表达明显增多(P 0. 05),E-cadherin表达显著减少(P 0. 01);与TGF-β_1组比较,PNS,白藜芦醇组,E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著增加(P 0. 01),α-SMA表达显著减少(P 0. 01),EMT发生被抑制,同时,SIRT1表达显著增加(P 0. 01),TGF-β_1,Smad3,Smad4表达显著降低(P 0. 01)。在SIRT1阻断剂EX527的干预下,PNS则不能发挥明显抑制作用。结论:PNS可以阻止TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生,其机制可能是通过激活SIRT1进而抑制TGF-β_1/Smad通路实现的。     

新加糖肾康对高糖环境下人肾小管上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白和E-钙黏蛋白的影响

目的观察新加糖肾康对高糖环境培养下人肾小管上皮细胞(HK-2)α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的影响,探讨其防治糖尿病肾间质纤维化的作用机制。方法含10%胎牛血清1640培养基体外培养HK-2细胞。实验分为空白对照组、高糖组、空白血清组和新加糖肾康低、中、高剂量组。药物干预后,MTT法检测细胞增殖,ELISA检测α-SMA和E-cadherin的含量。结果与空白对照组比较,HK-2细胞经高糖培养后细胞数量和α-SMA含量显著增加、E-cadherin含量明显降低(P0.05);与高糖组比较,新加糖肾康组α-SMA含量降低、E-cadherin含量增加、细胞增殖受到抑制。结论新加糖肾康能够抑制肾小管上皮细胞表型转化及细胞增殖,具有防治糖尿病肾间质纤维化的作用。     

人参皂苷Rg1对TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)上皮-间充质细胞转化(EMT)的作用及其与该细胞血红细胞生成素受体(EPOR)表达变化的关系。方法将体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白对照组、5μg/L TGF-β1刺激组,人参皂苷Rg1与TGF-β1共同干预组(5μg/L TGF-β1的基础上分别加入10,20,40 mg/L的人参皂苷Rg1)。每组细胞干预72 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变,并通过CCK8法检测人参皂苷Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响。酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定细胞培养上清液中胶原Ⅰ(Col-Ⅰ)和纤维粘连蛋白(FN)的含量。实时荧光定量PCR方法检测EPOR mRNA转录水平,免疫细胞化学法检测各组表达EPOR细胞的阳性率。结果 TGF-β1诱导NRK52E细胞形态变化,从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞形态,并抑制细胞增殖(P<0.05),增加细胞表达Col-Ⅰ和FN,抑制EPOR mRNA及其蛋白的表达(P<0.05);人参皂苷Rg1以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞形态的改变,减少Col-Ⅰ和FN的表达,上调EPOR mRNA及其蛋白的表达(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT具有一定的抑制作用;该作用可能与人参皂苷Rg1上调肾小管上皮细胞EPOR的表达有关。     

镰形棘豆提取物对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:本实验通过观察镰形棘豆提取物含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的作用,探讨其在肾间质纤维化方面的作用及机制。方法:采用镰形棘豆提取物(300mg/kg)给大鼠灌胃,每天2次,连续3天。3天后大鼠股动脉采血,分离血清,即得镰形棘豆提取物含药血清。体外培养HK-2细胞,培养基为含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1);细胞分为4组:空白对照组、空白血清对照组(TGF-β1 10 ng/ml+10%空白血清)、镰形棘豆提取物组(TGF-β1 10 ng/ml+10%镰形棘豆提取物含药血清)、转化生长因子-β1诱导组(TGF-β1 10 ng/ml)。药物干预细胞后,采用免疫组化技术测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,ELISA技术测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的含量,荧光定量PCR检测转化生长因子-β受体I(TβRI)、受体II(TβRII)的mRNA表达,Western blot检测Smad 2、smad 3的蛋白表达。结果:正常的HK-2细胞只表达E-cadherin,不表达α-SMA。但经TGF-β1诱导后细胞转分化,E-cadherin的表达开始减弱,α-SMA表达逐渐增强,药物干预后,α-SMA表达明显减弱,E-cadherin表达增强。与空白对照组相比,TGF-β1诱导组ColⅠ、ColⅢ、FN的含量显著增加,在24h时分别为(197.4±0.7)、(32.7±0.2)、(754.5±4.1),72h时分别为(216.4±0.8)、(38.3±0.1)(995.4±1.5),P﹤0.05;与TGF-β1诱导组相比,镰形棘豆提取物组ColⅠ、ColⅢ、FN的分泌显著下降,72h时作用更为显著,含量分别为(205.5±0.7)、(35.0±0.3)、(892.4±0.9),P﹤0.05。与空白对照组相比,TGF-β1诱导组TβRI(11.08±0.10)、TβRII(11.57±0.12)的mRNA表达和Smad 2(0.971±0.017)、smad 3(0.972±0.011)的蛋白表达显著上升,P﹤0.05;与TGF-β1诱导组相比,镰形棘豆提取物组TβRI(9.788±0.379)、TβRII(8.452±0.250)mRNA表达和Smad 2(0.536±0.013)、Smad3(0.530±0.035)蛋白表达也减少,P﹤0.05。空白血清则无此作用。结论:镰形棘豆提取物能够减少细胞外基质成分分泌,调控Smads信号通路,抑制肾小管上皮细胞转分化,在一定程度上具有防治肾间质纤维化的作用。     

加味六君子汤对腹膜纤维化大鼠TGF-β/Smad信号通路的影响

目的:探讨加味六君子汤对腹膜纤维化大鼠TGF-β/Smad信号通路的影响。方法:用5/6肾切除联合腹腔注射4.25%腹透液+脂多糖(LPS)建立腹膜纤维化大鼠模型,实验分空白组(A组)、模型组(B组)、西药组(C组)、中药高剂量组(D组)、中药低剂量组(E组),Western印迹法检测TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7和α-SMA、E-cadherin蛋白的表达:RT-PCR法测定TGF-β1、α-SMA、E-cadherin m RNA水平。结果:与A组相比,B组、C组、D组、E组TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA蛋白和α-SMAm RNA表达水平升高,有显著性差异(P0.05);与B组相比,C组、D组、E组TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA蛋白和α-SMAm RNA表达水平降低,Smad7和E-cadherin蛋白和E-cadherin m RNA表达水平增高,有显著性差异(P0.05)。结论:加味六君子汤可能通过TGF-β/Smad信号通路,抑制腹膜间皮细胞EMT进程,进而起到一定拮抗腹膜纤维化作用。     

糖耐康对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞Smad 2、3、7 mRNA表达的影响

目的观察糖耐康药物血清干预转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)Smad 2、3、7 mRNA的表达,探讨其在防治肾间质纤维化方面的作用。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL＋10%空白血清)、干预1组(TGF-β110 ng/mL＋5%糖耐康药物血清)、干预2组(TGF-β110 ng/mL＋10%糖耐康药物血清)、干预3组(TGF-β110 ng/mL＋20%糖耐康药物血清)。药物干预24 h后,荧光定量PCR检测Smad 2、3、7 mRNA的表达。结果 HK-2细胞经TGF-β1诱导后,Smad 2、3 mRNA的表达显著上升,而Smad 7的表达减弱,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),经糖耐康药物血清干预后,Smad 2、3 mRNA的表达逐步下降,而Smad 7 mRNA的表达逐步上升,与单纯TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论糖耐康在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化,其机制可能与调节纤维化信号通路Smad 2、3、7mRNA表达有关。     

止消通脉宁干预转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的研究

目的观察止消通脉宁药物血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化的影响,并探讨其机制。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养并分为空白对照组、TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、干预1组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁药物血清)、干预2组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁药物血清)、干预3组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁药物血清)。药物干预24 h后,免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。在24、48、72 h应用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的含量。结果正常HK-2细胞表达E-cadherin,不表达α-SMA,经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变,E-cadherin的表达明显减弱,α-SMA表达明显增强,且ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。止消通脉宁药物血清干预后α-SMA表达明显减弱,E-cadherin表达明显增强;同时抑制了ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌,与TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论止消通脉宁在一定程度上能够抑制人肾小管上皮细胞表型转化,减少细胞外基质成分的分泌,具有防治肾间质纤维化的作用。     

糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对TGF-β1、HO-1干预作用的研究

[目的]探讨糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对转化生长因子(TGF)-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血红素氯合酶-1(HO-1)干预作用。[方法]制备小鼠含药血清;培养肾小管上皮细胞分为:空白对照组、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、空白血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、糖肾方低剂量血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%低剂量含药血清)、糖肾方高剂量血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%高剂量含药血清)。使用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖的影响。运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测肾小管上皮细胞中TGF-β1、HO-1和α-SMA蛋白的表达。[结果]高糖诱导下,肾小管上皮细胞呈成纤维细胞样的长梭形,细胞核呈梭形改变。MTT检测:与空白组比较,高糖组光度值明显增高(P0.05);与高糖组比较,高低剂量含药血清组在培养24 h后吸光度值均有下降,吸光度差异有统计学意义(P0.05),且高剂量组光度值下降强于低剂量组(P0.05)。Western blotting及RT-PCR测定实验结果显示:与空白对照组细胞对比,高糖组中TGF-β1、α-SMA含量增加;经过含药血清干预后,高糖诱导的HK-2细胞TGF-β1、α-SMA含量降低,差别有统计学意义(P0.05);糖肾方高、低剂量组血清比较,在降低TGF-β1方面,高剂量组效果较好(P0.05),在降低α-SMA方面没有统计学差异(P0.05)。HO-1在高糖诱导后含量稍升高,与空白对照组对比,差异有统计学意义(P0.05);在经过糖肾方含药血清干预后,含量升高,与高糖组对比,差异有统计学意义(P0.05),糖肾方高低剂量组血清比较,升高HO-1含量方面没有统计学差异(P0.05)。[结论]糖肾方通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和干预TGF-β1、α-SMA、HO-1相关分子的表达,可以抑制细胞外基质成分沉积,减少氧化应激反应,减轻细胞损伤,逆转上皮-间质转分化,从而抑制肾间质纤维化,延缓糖尿病肾病病情进展。     

新加糖肾康对高糖环境下HK-2细胞TGF-β/Smads信号通路的影响

目的:通过观察新加糖肾康(TSK)对高糖环境培养下人肾小管上皮细胞(HK-2)TGF-β/Smads信号通路的影响,探讨其防治糖尿病肾病的作用机制。方法:体外培养HK-2细胞,培养基为含10%胎牛血清的1640培养基,实验分为6组:空白对照组、高糖组(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清对照组(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加糖肾康低剂量组(30 mmol/L D-葡萄糖+5%TSK药物血清)、新加糖肾康中剂量组(30 mmol/L D-葡萄糖+10%TSK药物血清)、新加糖肾康高剂量组(30 mmol/L D-葡萄糖+20%TSK药物血清)。ELISA法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、转化生长因子-β受体I(TGF-βRⅠ)、转化生长因子-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)、Smad2、Smad3的表达。结果:HK-2细胞经高糖环境培养后TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3的含量显著增加,与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。但经新加TSK干预后其含量下降,与高糖组相比差异有统计学意义(P0.05)。结论:中药复方TSK能够抑制肾小管上皮细胞TGF-β/Smads信号通路,具有防治糖尿病肾间质纤维化的作用。     

血府逐瘀汤对肺纤维化大鼠肺组织上皮间质转化的影响及其机制研究

目的:研究血府逐瘀汤对肺纤维化(PF)大鼠肺组织上皮间质转化(EMT)的影响,并探讨其可能机制。方法:将48只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(0.000405 g·kg~(-1)·d~(-1))和血府逐瘀汤高、中、低剂量组(14.04、7.02、3.51 g·kg~(-1)·d~(-1)),每组8只。除正常组外,其余各组大鼠均于气管内滴注博来霉素溶液建立PF模型。造模后第2天开始灌胃给药,正常组和模型组予蒸馏水溶液(10 m L·kg~(-1)·d~(-1));各给药组灌胃相应药物,每日1次,连续28 d。末次给药24 h后,采用免疫组化法检测大鼠肺组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,采用Western blot法检测大鼠肺组织中TGF-β1、Smad3的表达情况。结果:模型组大鼠肺组织E-cadherin表达显著低于正常组(P 0.01),而α-SMA、TGF-β1、Smad3表达均显著高于正常组(P 0.01);与模型组比较,血府逐瘀汤高、中、低剂量组肺组织E-cadherin表达显著升高(P 0.05或P 0.01),而α-SMA、TGF-β1、Smad3表达均显著降低(P 0.05或P 0.01);与地塞米松组比较,血府逐瘀汤低剂量组的E-cadherin表达显著降低(P 0.05),而α-SMA、TGF-β1、Smad3表达均显著升高(P 0.05或P 0.01)。结论:血府逐瘀汤可通过干预上皮间质转化来减轻肺纤维化,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。     

黄芪总黄酮对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响

目的探究黄芪总黄酮对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响。方法大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组(秋水仙碱,50 mg/kg)和黄芪总黄酮低、中、高剂量(25、50、100 mg/kg)组。HE染色观察大鼠组织病理学变化,ELISA法检测大鼠血清ALT、AST活性及HA、LN、PCⅢ、CⅣ、IL-1β、IL-6、TNF-α水平,Western blot法检测α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表达。结果与模型组比较,黄芪总黄酮组能抑制肝细胞坏死、炎细胞浸润以及纤维化,显著降低ALT、AST活性,HA、LN、PCⅢ、CⅣ,以及IL-1β、IL-6、TNF-α水平和α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论黄芪总黄酮可抑制四氯化碳诱导大鼠肝纤维化,其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路介导的炎症反应有关。     

薯蓣皂苷元对LPS诱导的人胚肺成纤维细胞的干预机制研究

目的基于MAPK信号通路研究薯蓣皂苷元对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的影响,探讨薯蓣皂苷元干预肺间质纤维化的机制。方法通过LPS诱导MRC-5细胞建立肺纤维化模型,利用CCK-8法检测细胞增殖水平,免疫荧光法检测α-平滑肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)表达水平,ELISA法检测TGF-β1、IL-6蛋白表达水平,Western blot测定p-38、p-p38、jnk、p-jnk表达水平。结果以LPS诱导MRC-5细胞能够成功建立肺纤维化细胞模型,40μmol/L薯蓣皂苷元组细胞增殖水平较模型组明显降低(P0.01),薯蓣皂苷元组α-SMA表达水平较模型组均有明显下降(P0.01)。与模型组比,10μmol/L薯蓣皂苷元组、40μmol/L薯蓣皂苷元组TGF-β1表达水平明显下降(P0.01),20μmol/L薯蓣皂苷元组TGF-β1表达水平未见明显下降(P0.05);与模型组比,10μmol/L薯蓣皂苷元组IL-6表达水平未见明显下降(P0.05),而20μmol/L及40μmol/L薯蓣皂苷元组IL-6表达明显高于模型组(P0.01);各组p-38、jnk表达水平无明显差异(P0.05),p-p38、p-jnk表达水平薯蓣皂苷元组较模型组明显下降(P0.01)。结论薯蓣皂苷元通过下调LPS诱导的MRC-5细胞中的TGF-β1的表达,可以抑制Smad通路及非Smad通路中诱导肺纤维化的信号通路,阻碍上皮细胞间质化(EMT)进程。并且通过下调TGF-β1表达,薯蓣皂苷元可以有效地抑制MAPK通路中的p38MAPK通路及jnk通路的磷酸化激活,降低α-SMA表达,减少炎性反应、细胞凋亡的发生,从而达到抗肺纤维化的目的。