弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

人rgs4真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建人rgs4基因真核表达质粒。方法采用RT-PCR方法,扩增人rgs4基因片段,插入真核表达质粒pcDNA3．1中,转化大肠杆菌DH5a,通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和测序验证阳性重组克隆。结果RT—PCR自人胚肾上皮细胞（HEK293）中扩增出目的基因片段,插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致,测序结果证明为人rgs4基因。结论成功构建了人rgs4编码框全长的真核细胞表达质粒。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因DNA序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒GPEM－G vector, 经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDNA3．1（＋）,构建成PCDNA3．1－HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

小鼠Hsp84真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建小鼠Hsp84基因真核表达质粒。方法：采用逆转录、热降落PCR方法，扩增BALb／c小鼠Hsp84基因片段。将其连人pMD18-T载体，筛选阳性克隆、测序验证。然后以重组T载体为模板，PCR扩增目的序列，插入真核表达质粒pcD—NA3.1中，转化大肠杆菌DH5α，通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和验证阳性重组克隆。结果：RT—PCR自小鼠脑组织中扩增出目的基因片段，克隆人pMD18-T载体后，测序结果证明为BALb／c小鼠Hsp84基因．插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致。结论：成功构建了小鼠Hsp84编码框全长的真核细胞表达质粒。     

弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的：构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒，为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法：自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子，用酚／氯仿法提取基因组DNA，用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化)，定向插入到PQE-30表达质粒中，转化入TG1宿主菌，在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子，采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果：阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp，通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论：成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。     

小鼠FGFR1/MIP3a-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法 设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果 经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

SP1调控PIWIL1基因启动子转录活性研究

目的 克隆转录因子SP1编码序列,构建真核表达质粒PCDNA3.1-SP1,并研究其对PIWIL1基因转录活性的影响。方法 RT-PCR法从正常人外周血总RNA中钓取SP1基因的编码序列,插入至真核表达载体PCNDA3.1（+）,酶切及测序鉴定重组质粒。Western blot法分别验证重组表达载体的在COS-7细胞中的表达效应。分别将活性最高的PIWIL1基因启动子报告基因截短体（即核心启动子区域）、活性最低的PIWIL1基因启动子报告基因截短体,与SP1重组质粒共转染COS-7细胞,利用Dual-Luciferase reporter assay system测定不同启动子活性区的PIWIL1基因转录活性的改变,同时应用光辉霉素A下调SP1的表达来进一步验证SP1对PIWIL1活性的影响。结果 酶切及测序鉴定结果显示SP1表达质粒构建成功,Western blot法结果表明重组SP1表达载体能有效表达于COS-7细胞,过表达SP1可明显提高PIWIL1不同活性区的启动子的活性（P<0.05）。结论 外源性SP1真核表达载体转染能有效表达于COS-7细胞,并对PIWIL1的转录活性起着上调的作用,提示SP1可能是PIWIL1转录活性的正调控元件之一。     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.