基于IgY的间接凝集试验检测日本血吸虫感染小鼠血清中循环抗原

【目的】 间接凝集实验(IHA)是将抗原或抗体吸附于致敏红细胞表面作为检测试剂来检测标本中的相应抗体或抗原的血清学方法,是血吸虫病疫区应用最广泛的免疫学诊断方法。但由于其较低的敏感性和特异性、红细胞的批间差异以及较高的假阳性率等缺点,现场诊断价值大打折扣。IgY(Immunoglobulin of egg yolk)是鸡卵黄中的免疫球蛋白,相比哺乳动物的IgG,IgY可与抗原上的更多表位反应,放大信号,提高诊断敏感性。且其不与补体、抗体及人或细菌Fc受体等结合,减少了样本中无关因子的干扰从而避免假阳性或假阴性结果。本实验结合IgY的优点,引用IHA的原理,以工业化的纳米磁珠代替致敏红细胞避免批间差异,建立基于IgY的免疫磁珠间接凝集试验,用于检测血吸虫感染小鼠血清中的循环抗原,为检测血吸虫循环抗原提供一种新的技术。 【方法】 从血吸虫感染的兔肝脏中收集虫卵,制备可溶性虫卵抗原(SEA)。用SEA皮下免疫莱杭鸡,制备纯化抗SEA的IgY抗体,将抗SEA的IgY抗体与纳米磁珠偶联制成免疫磁珠。建立血吸虫感染小鼠模型,收集感染前后不同时间(2、4、6、8、10和12周)小鼠血清标本。按IHA的操作进行试验,检测感染小鼠血清中循环抗原。 【结果】 本实验成功制备了分子量为130 kDa的anti-SEA IgY多克隆抗体,该抗体可特异性地识别血吸虫SEA中140 kDa、100 kDa和69 kDa三种抗原成分。免疫磁珠间接凝集试验可检测出重度感染组感染后6周以及轻、中度感染组感染后8周血清中的循环抗原,并且血清反应的强度与小鼠感染度、感染时间呈正相关。 【结论】 本课题组成功建立了基于IgY的免疫磁珠间接凝集试验,此法可有效地检测出不同感染度小鼠血清中循环抗原。为血吸虫循环抗原的检测提供了一种高敏感性和特异性,操作简便快捷的诊断方法,可提高免疫诊断试验在血吸虫病防治活动中的实用价值。     

血吸虫源性Treg细胞诱导分子的筛选及机制研究

【立论依据及设计思路】 血吸虫病是我国及世界最重要寄生虫病之一,主要因虫卵引起肝脏肉芽肿、纤维化并继发门脉高压症等严重后果,使患者丧失劳动能力、生活自理能力甚至死亡。然而,血吸虫感染后会诱导宿主产生显著的免疫负调控来抑制肝脏病理免疫损害进展,使宿主能存活较长时期,感染呈慢性化。此时,抗体和细胞因子等应答被显著抑制;白喉毒素、BCG等多种疫苗的接种效果被显著削弱;还抑制了由Th1类(如I型糖尿病、克隆性结肠炎等)和Th2类(过敏性哮喘等)应答介导的诸多免疫疾病。迄今,公认血吸虫感染后引起免疫负调控的最重要机制是虫卵抗原诱导了具有免疫抑制力的CD4⁺CD25⁺ Treg细胞,但诱导机制未明。 【实验内容】 为从血吸虫卵中找到可诱导Treg细胞的分子并阐明诱导机制,拟:(1)以两套方案同时初筛:第一方案参照已知可诱导Treg细胞的表位(Treg细胞表位,Tregitope),在虫卵基因库中筛选含有表位最多的分子用于Treg细胞体外诱导实验,选择诱导能力最强者。第二方案参照已知可诱导Treg细胞的分子特点,在虫卵基因库中选择最相似分子用于Treg细胞体外诱导实验,选择诱导能力最强者。(2)将上述两方案中初筛到的分子免疫小鼠,以体内实验复核其对Treg细胞的诱导能力。(3)最终选取一个诱导作用最强的分子,以哮喘或免疫性关节炎小鼠疾病模型进行免疫抑制功能验证(治疗性)实验。(4)初步探索该分子诱导Treg细胞的机制。 【可行性】 (1)已通过生物信息学分析在虫卵基因库中筛选到数个含Tregitope最多的虫卵蛋白分子;(2)已通过生物信息学分析结合体外诱导和小鼠免疫实验筛选到数个可诱导Treg细胞的虫卵蛋白分子。 【创新性】 不仅有助于揭示慢性感染时宿主控制病理免疫损害的机制,还期待从血吸虫卵中找到可用于新型免疫抑制剂研发的具有自主知识产权的分子。     

日本血吸虫PP2C蛋白磷酸酶的鉴定与功能研究

【立论依据】 日本血吸虫广泛流行于我国长江流域及以南地区,累计感染者超过8 000万,对人类的危害极大。目前日本血吸虫全基因组测序工作已经完成,但对于其重要基因的功能的研究却较少。 【设计思路】 蛋白质的可逆磷酸化是真核细胞的一个关键调控机制,其中蛋白磷酸酶是生物体内重要的调节因子,广泛参与细胞周期循环、细胞分化与凋亡、信号转导等生命活动。目前,蛋白磷酸酶在寄生虫生长发育过程中的作用已逐渐受到人们的重视。在血吸虫的研究中发现,外源的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶可诱导小鼠产生有效的保护性免疫,抑制虫体的繁殖。而在弓形虫中的研究还发现,提高其PP2C磷酸酶活性可显著抑制虫体的繁殖。而在酿酒酵母等模式生物中的研究均发现,PP2C磷酸酶在细胞周期循环等过程中也发挥着重要的作用。但迄今为止,对于日本血吸虫PP2C蛋白磷酸酶的认识却几乎空白,本课题对其功能的研究有助于血吸虫病的临床治疗和新药的研发。 【实验内容】 采用PCR等方法克隆日本血吸虫PP2C蛋白磷酸酶编码基因,构建原核表达载体;进行诱导表达,并检测表达产物的去磷酸化活性;利用RT-PCR检测PP2C蛋白磷酸酶的组织特异性;利用融合PCR方法构建带有酿酒酵母启动子的日本血吸虫PP2C基因,并导入酿酒酵母PP2C缺失株,检测其与酿酒酵母PP2C功能上的联系。 【材料】 本实验主要以日本血吸虫为实验材料,同时,实验中还会利用酿酒酵母PP2C蛋白磷酸酶缺失株;原核表达载体采用pET28a,酿酒酵母表达载体采用pRS316和pHAC181。 【可行性】 前期我们已经鉴定了白念珠菌中的PP2C蛋白磷酸酶,建立了成熟的研究方案。此外,经过序列分析,我们已经初步找到日本血吸虫中编码PP2C蛋白磷酸酶的10个基因,经过生物信息学方法分析其具有 PP2C催化结构域。 【创新性】 本研究首次对日本血吸虫的PP2C蛋白磷酸酶进行鉴定和功能研究,对于理解其在日本血吸虫生命活动中的作用有重要意义,可为血吸虫病的防治提供理论指导。     

外源性IL⁃25对日本血吸虫感染引起肠壁损伤的影响

目的：探究外源性白细胞介素（interleukin,IL）-25对日本血吸虫感染所致小鼠肠壁损伤的影响。方法：24只雌性 C57BL/6J小鼠随机分为正常组、正常+IL-25组、感染组、感染+IL-25组。感染组、感染+IL-25组中每只小鼠感染日本血吸虫尾蚴40条;感染+IL-25组、正常+IL-25组小鼠于感染后或实验开始后第4周开始腹腔注射IL-25（0.5 μg/只,隔天注射1次,持续 3周）。感染6周后剖杀小鼠,取肝脏和肠组织制作病理切片,苏木素伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色后观察小鼠肝脏、结肠病理学变化,阿尔新蓝-过碘酸雪夫（Alcian blue-periodic acid-Schiff,AB-PAS）染色观察小鼠结直肠内杯状细胞数量变化;酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、实时荧光定量试验（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR） 检测小鼠结肠部位炎症相关因子IL-10、IL-4、IL-13、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、γ干扰素（interferon γ, IFN-γ）和IL-1β等的表达水平。结果：感染6周后的肠组织HE染色结果显示,日本血吸虫感染后,结直肠部位出现虫卵堆积, 但是在经过IL-25注射之后,肠道损伤减轻,虫卵堆积减少;感染+IL-25组小鼠肠道单个肉芽肿面积显著低于感染组小鼠,但是感染组小鼠肝脏肉芽肿面积与感染+IL-25组小鼠无明显区别;AB-PAS结果显示IL-25能够显著增加日本血吸虫感染小鼠肠道杯状细胞数量;ELISA、real-time PCR结果显示感染日本血吸虫后小鼠结肠1型、2型细胞因子均有不同程度的升高,且在注射 IL-25之后,呈现2型细胞因子表达量上升、1型细胞因子表达量下降的趋势。结论：IL-25可通过促进杯状细胞分化缓解日本血吸虫感染所致的肠壁损伤。     

α-倒捻子素对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

【立论依据及设计思路】 化学性肝损伤发病率高,迄今无理想的治疗方法。α-倒捻子素(1,3,6-三羟基-7-甲氧基-2,8-双(3,3-二甲基烯丙基)呫吨酮,α-Mangostin)为山竹果实的主要提取物之一,已有研究表明其具有抗炎、抗氧化等生物学活性,迄今尚无抗化学性肝损伤作用的研究报道。本实验研究α-倒捻子素对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤的保护作用及可能机制。 【实验内容】 (1)α-倒捻子素低、中、高剂量组小鼠连续14 d腹腔注射α-倒捻子素预处理,模型组给予同体积溶剂,阳性对照组给予silymarin (25 mg/kg i.g.)。给除溶剂对照组外的其余各组小鼠腹腔注射CCl4,测定小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平;肝组织切片进行病理组织学观察;(2)探明其保护作用与抗氧化活性的关联性,拟检测小鼠肝组织匀浆中的谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;(3)在分子水平上明确α-倒捻子素的抗氧化作用,用体外培养原代肝细胞,研究α-倒捻子素抵抗CCl4所致线粒体膜电位降低及线粒体功能损伤的作用,分析相关的信号分子和通路的改变。 【材料】 体重25 g雄性ICR小鼠60只;ALT、AST、GSH、MDA、SOD等试剂盒;silymarin;α-倒捻子素;四氯化碳;D-Hank's液,0.2%IV型胶原酶,胎牛血清,DMEM培养基;Mito-Tracker Red染料,DCFH-DA染液,JC-1染液,ATP检测试剂盒。 【可行性】 我们的预实验研究表明,α-倒捻子素可部分逆转四氯化碳所致肝细胞的损伤以及血清中ALT、AST的升高,提示α-倒捻子素对四氯化碳所致化学性肝损伤具有保护作用。初步预实验还发现,α-倒捻子素的保护作用可能与抗氧化活性相关。 【创新性】 发现α-倒捻子素对四氯化碳所致化学性肝损伤具有保护作用且其保护作用可能与抗氧化、保护线粒体功能有关。     

旋毛虫感染致宿主行为学损失及与激素水平相关性的研究

【立论依据】 旋毛虫是一种在多种哺乳动物中广泛传播的寄生虫。其成虫和幼虫分别寄生在同一宿主的小肠和肌肉内。旋毛虫的唯一传播方式是食入含有活幼虫的肌肉组织。基于寄生虫操纵(Parasite manipulation)理论,寄生虫在生存压力下,会进化出某种机制,改变宿主的某些行为,增加宿主被捕食者捕食的几率,从而有利于寄生虫的传播。有研究表明,旋毛虫感染小鼠会出现胃肠道炎症、食欲减退、活动减少等临床表现以及某些社会行为的减退等,以上种种改变,可能使得宿主身体素质变差,易于脱离群体,从而增加被捕食者捕食的机会。 【设计思路】 旋毛虫的感染方式只能是食入含有活幼虫的肌肉组织,因而我们设想感染了旋毛虫的小鼠会出现行为学上的损失,从而使得旋毛虫更易完成生活史。为了验证这一假设,本研究拟用行为学分析仪观察、记录并分析小鼠感染旋毛虫后行为学上的一系列变化,并进而检测旋毛虫感染后相关激素水平的变化,试图阐述行为学改变的可能机制。 【实验内容】 旷场实验观察小鼠自发活动和探索行为水平;用猫尿等刺激物观察小鼠对天敌的规避反应;观察旋毛虫感染对小鼠的配偶选择及个体社会等级的建立、维持、逆转的影响;检测小鼠体内17β雌二醇和睾丸酮水平的变化。 【材料】 雌性及雄性昆明鼠,RIA激素测量试剂盒,动物行为学分析系统。 【可行性】 本项目基于寄生虫操纵理论设计了感染旋毛虫小鼠行为学的完整观察体系并检测小鼠的激素水平变化,相关实验设计既有理论指导,也有成熟的技术路线,可行性强。小组成员已基本掌握小鼠建模、行为学观察和激素检测等相关技术。 【创新性】 本项目首次观察了感染后的小鼠对捕食者的反应等一系列行为学,以期阐明感染除了使宿主变得虚弱外,也会通过使宿主对捕食者不敏感,增加宿主被捕食的机会从而利于寄生虫延续种族。     

TRPM2在机械性创伤引发单核细胞TNF-α过量产生中的作用及其机制

【立论依据】 车祸、地震等造成的机械性创伤(MT),可以造成心脑等重要器官的继发性损伤。前期的研究表明,MT引发的TNF-α过量产生是导致继发性心肌损伤的关键环节,然而其机制却不清楚。TRPM2是非选择性阳离子通道,在氧化应激情况下开放。由于单核细胞是产生TNF-α的主要细胞,故本课题以TRPM2为切入点,研究MT引发单核细胞TNF-α过量产生的机制。 【设计思路】 依次解决下述三个问题:(1)TRPM2在MT引发单核细胞TNF-α过量产生中是否发挥重要的作用?(2)TRPM2在MT引发TNF-α过量产生中的作用机制,主要观察通过TRPM2通道的开放是否与UCP2有关?(3)通过该通道内流的钙离子,是否通过ErK/NF-κB通路介导TNF-α的过量产生? 【实验内容】 (1)在培养的单核细胞液中,分别使用TRPM2通道阻断剂、Ca²⁺清除剂、相关溶剂和基因沉默技术,观察在培养液中添加创伤动物血浆(TP)引发的培养液中TNF-α浓度的变化;(2)使用TRPM2基因敲除鼠,观察MT造成的动物血浆中TNF-α浓度变化;(3)使用膜片钳和检测细胞内钙变化,从功能上观察在单核细胞上的TRPM2通道,是否参与TP引起的钙离子内流;(4)动物实验,观察MT后,UCP2的蛋白表达是否增强;使用UCP2抑制剂,观察MT后血浆TNF-α产生量的变化;(5)膜片钳观察,使用UCP2抑制剂,观察是否可抑制TP引起的单核细胞TRPM2通道开放和细胞内钙上升;(6)单核细胞培养,使用TRPM2阻断剂和siRNA基因沉默TRPM2,观察培养液中添加TP后,对ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况;(7)动物实验,观察TRPM2基因敲除鼠和对照鼠,创伤后ErK的表达、NF-κB的表达和核内移情况。 【材料】 使用雄性成年C57B16/J小鼠和TRPM2基因敲除鼠。 【可行性】 (1)申请人所在实验室具有完成上述实验的全部实验仪器,本课题组实验技术成熟,人员配备较好。(2)实验所用TRPM2基因敲除鼠可以从日本国立自然科学研究机构获得。 【创新性】 (1)以TRPM2为靶点,研究其在MT引发TNF-α过量产生中的作用。(2)研究TRPM2通道与UCP2的关系。(3)观察TRPM2通道是否通过ErK/NF-κB通路介导MT引发的TNF-α过量产生。     

细胞表面α2,6-唾液酸在肝癌细胞粘附中的作用及机制研究

【目的】 分析比较细胞表面不同连接方式的唾液酸在小鼠肝癌高淋巴道转移细胞株Hca-F和低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达,并研究差异性表达的α2,6-唾液酸在肝癌细胞淋巴结黏附行为中的作用及分子机制。 【方法】 利用免疫细胞化学、流式细胞技术,分析肝癌细胞表面不同连接方式的唾液酸在Hca-F和Hca-P中的表达差异;通过RNA干扰技术干预差异表达的唾液酸转移酶,并使用RT-PCR、蛋白质印迹及Lectin-blot方法检测其干扰效果;利用细胞黏附实验和凝集素阻断实验,检测干扰前后、阻断前后Hca-F细胞黏附能力的变化;利用FAK信号通路特异性抑制剂,探讨α2,6-唾液酸介导肝癌细胞黏附行为的分子机制。 【结果】 α2,6-唾液酸在小鼠肝癌高、低转移细胞株中表达具有显著差异,而α2,3-唾液酸的表达无显著差异;当通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中ST6Gal-I表达下调时,其细胞表面α2,6-唾液酸表达减少,削弱Hca-F细胞对淋巴结的黏附能力降低。此外,ST6Gal-I表达下调可抑制p-FAK及下游p-paxillin蛋白分子的表达。 【结论】 细胞表面α2,6-唾液酸可通过FAK信号转导通路正性介导肝癌细胞的黏附行为,为肝癌的治疗提供新的靶点。     

临床结核分枝杆菌RskA E83D突变对细菌SigK操纵子调控效应的影响分析

【目的】 针对本研究小组首次发现的,大量临床分离的北京型结核分枝杆菌中SigK 操纵子RskA编码基因的特殊表达模式,比较其对细菌形态、生理、毒力等的影响并初步分析产生这种影响的分子机制。 【方法】 以课题组构建的重组海分枝杆菌为研究对象,比较分析细菌体外培养、THP1细胞内培养、小鼠感染模型内形态、生长能力及毒力特征。检验重组细菌一线、二线抗结核药物的耐受性。采用qRT-PCR方法检测相关基因的表达水平,分析SigK操纵子表达与机体内环境的关系。利用比较蛋白质组学技术,寻找与SigK操纵子RskA E83D突变相关的蛋白调控网络。 【结果】 RskA E83D突变会抑制细菌在低氧状态以及贫营养状态下的生存能力,同时抑制在THP1胞内的生存能力。改变细菌中部分一线、二线抗结核药物靶基因的表达水平,从而影响药物抗性。RskA E83D突变蛋白高水平表达菌株感染的小鼠28 d后肺、脾组织结构中出现了明显淤血和水肿,并伴有大面积炎症细胞浸润,导致菌株致病力增强。 【结论】 北京基因型结核分枝杆菌RskA E83D这种突变可能会影响SigK/RskA的相互结合,影响SigK的表达,并最终改变高度免疫原性蛋白MPT83、MPT70的分泌水平。本研究的进行有助于揭示SigK特殊的调节机制,以及这种调节机制对临床菌株的流行病学播散、细菌耐药性、致病性的影响。     

移植转导自身免疫调节因子的骨髓细胞对I型糖尿病预防和治疗的实验研究

【立论依据】 I型糖尿病又称自身免疫性糖尿病,是由于自身免疫耐受机制打破、自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞所致的自身免疫性疾病。迄今对自身免疫病的治疗方案多不理想,目前常规采用的免疫抑制手段不但降低患者免疫力,也使疾病容易复发。理想的治疗自身免疫病的策略是特异性清除自身反应性T细胞,重建对自身组织抗原的免疫耐受。而自身免疫调节因子(AIRE)恰在胸腺阴性选择中具有调控组织限制性抗原(TRAs)表达、促进自身反应T细胞的清除、参与免疫耐受诱导的功能。因此,我们设想利用基因转导手段操纵骨髓细胞中AIRE的表达,通过模拟胸腺的阴性选择,诱导免疫耐受,为I型糖尿病的防治提供新策略。 【设计思路】 本实验拟通过以自身免疫糖尿病小鼠(NOD鼠)为模型,移植表达AIRE的骨髓细胞,使其在NOD鼠体内通过调控TRAs的表达清除自身反应性T细胞,观察其诱导特异性清除对胰腺组织特异性T细胞的作用及对NOD鼠糖尿病发生的影响,探索I型糖尿病防治新方法。 【实验内容】 (1)构建编码小鼠AIRE的逆转录病毒载体,将其转导入骨髓DCs细胞。(2)将转导AIRE的骨髓DCs细胞移植至经放射线照射的NOD小鼠,获得NOD嵌合鼠。(3)采用流式细胞术检测NOD嵌合鼠胸腺和脾脏中GFP⁺细胞数量,检测NOD鼠嵌合程度。(4)采用real-time PCR法、流式细胞术检测Ins2 mRNA水平和蛋白水平表达变化,检测AIRE对TRAs的调控作用。(5)检测NOD鼠糖尿病发生时间和程度以及其病理学和胰岛素自身抗体的改变。 【材料】 NOD鼠、编码AIRE的逆转录病毒载体、real-time PCR仪、流式细胞仪、葡萄糖检测试剂盒、尿糖试纸、ELISA试剂盒等。 【可行性】 前期工作中,以胸腺阴性选择为理论依据,对AIRE的表达、分布及其在自身耐受中的作用进行了系统、深入的研究,现以基因转导和骨髓细胞移植为技术手段,切实可行。 【创新性】 本研究首次将基因操纵和骨髓细胞移植两大先进技术相结合,利用AIRE能特异性清除自身反应性T细胞的功能,探究治疗I型糖尿病的方法,为自身免疫疾病的防治提供新思路。     

α干扰素治疗小鼠日本血吸虫病肝纤维化实验研究

目的观察IFN-α是否具有抗日本血吸虫病肝纤维化的作用及疗效.方法以日本血吸虫尾蚴感染IcR小鼠造成肝纤维化模型.10周后顿服吡喹酮杀虫治疗,继以IFN-α皮下注射治疗,并与模型对照组和0.9%氯化钠注射液治疗组比较.肝脏组织切片作苏木素-伊红、苦味酸-酸性品红染色,观察肝脏虫卵肉芽肿平均大小、胶原面积百分比及肝纤维化程度（SSS评分）.结果IFN-α治疗组肝脏虫卵肉芽肿平均大小缩小（P〈0.05）、胶原面积百分比降低（P〈0.05）、SSS评分较模型对照组下降〉2分（P〈0.05）.结论IFN-α治疗小鼠日本血吸虫病肝纤维化有效.     

弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP的制备、鉴定及免疫保护效应

【立论依据】 弓形虫微线体分泌的粘附蛋白MIC2与M2AP(MIC2相关蛋白)以1∶1的比例形成MIC2-M2AP六聚复合体,转移到弓形虫顶端与宿主细胞膜之间形成的连接区域,协助虫体进入宿主细胞。 【设计思路】 制备弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP,鉴定其免疫原性和免疫反应性及其在抗弓形虫入侵宿主细胞中的作用,为筛选MIC2-M2AP作为弓形虫疫苗候选抗原的研究奠定基础。 【实验内容】 RT-PCR扩增弓形虫MIC2和M2AP基因,克隆至组成型表达的毕赤酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组真核表达质粒 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,利用同源重组的方法将MIC2和M2AP基因整合到同一毕赤酵母细胞X33的基因组中进行发酵表达获得重组MIC2-M2AP复合体,His标签Ni-NTA柱亲和层析纯化后免疫小鼠,采用免疫小鼠血清和弓形虫感染鼠血清进行蛋白质印迹鉴定重组MIC2-M2AP复合体的免疫原性和免疫反应性,免疫小鼠抗重组MIC2-M2AP复合体多抗血清体外中和实验观察阻断弓形虫入侵宿主细胞效应,重组MIC2-M2AP复合体免疫小鼠的抗弓形虫感染效应。 【材料】 弓形虫RH株速殖子,毕赤酵母表达载体pGAPZαA。 【可行性】 国外文献已经证实MIC2-M2AP复合体在协助虫体的滑移运动和侵入细胞中发挥重要的作用,敲除MIC1基因后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降50%,敲除MIC2的结合蛋白M2AP后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降80%以上,因此重组MIC2-M2AP复合体有可能作为弓形虫疫苗候选抗原。目前我们已成功构建了重组真核表达载体 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,其核苷酸序列与GenBank中的序列同源性为100%。 【创新性】 国内外在弓形虫疫苗候选抗原筛选研究中,目前报道较多的是弓形虫表面抗原(SAG)、棒状体蛋白(ROP)、致密颗粒抗原(GRA)等可能作为弓形虫疫苗候选抗原的研究,而关于微线体蛋白(MIC)尤其是MIC2-M2AP复合体可作为弓形虫疫苗候选抗原的研究未见报道,而根据已报道的微线体蛋白相关研究成果,我们推测重组MIC2-M2AP复合体免疫会产生较强的免疫保护效果。     

抗日本血吸虫单抗识别曼氏血吸虫表面蛋白的研究

【目的】 证明本实验室所制备的抗日本血吸虫表面蛋白(Sj29)的单克隆抗体可识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29),拓宽抗Sj29单克隆抗体的用途,为今后研发检测血吸虫病的通用型试剂盒打下基础。 【方法】 通过基因工程技术和分子生物学技术扩增曼氏血吸虫表面蛋白基因(Sm29)并与T载体连接,连接产物转化至感受态细胞(大肠埃希菌),挑取单菌落,摇菌,提质粒双酶切鉴定,测序,再将测序正确的Sm29基因与真核表达载体pEGFP-C2连接,构建重组真核表达质粒,再将该重组质粒转染至真核细胞COS-1中表达,荧光显微镜观测转染效率。最后用蛋白质印迹技术和细胞爬片免疫组化两种方法验证抗Sj29单克隆抗体和兔日本血吸虫感染血清能否识别Sm29蛋白。 【结果】 经酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,所得的条带的位置及大小均与目的基因的位置及大小相一致,并且目的基因测序结果的相似度为99%,其中1%突变的碱基为无义突变类型,对蛋白的表达没有影响。荧光显微镜下观察转染效率为30%~40%。用日本血吸虫表面蛋白(Sj29)和曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29)分别作为一抗进行蛋白质印迹,其结果显示此株抗Sj29单克隆抗体均能识别上述两种蛋白,并且其识别日本血吸虫表面蛋白(Sj29)的位置位于20 kd左右,而其识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29)的位置位于55 kd左右,这两种结果均符合预期结果。以抗Sj29的单克隆抗体和日本血吸虫感染的兔血清分别为一抗作免疫组化,其结果均呈阳性,其对照组分别以PBS和正常兔血清为一抗,结果均呈阴性。说明抗Sj29的单抗不仅可以识别Sm29蛋白,同时感染兔血清中的抗体也可以识别曼氏血吸虫表面蛋白(Sm29),进一步提高了以后研发检测血吸虫病通用试剂盒的可行性。 【结论】 抗Sj29单克隆抗体能识别Sm29蛋白,为今后研发检测血吸虫循环抗原的通用型试剂盒打下基础。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

ω-3多不饱和脂肪酸对新生儿缺血缺氧所致脑瘫的防治作用

【立论依据】 脑瘫是新生儿尤其是早产儿最常见最严重的并发症之一,缺血缺氧(HI)是主要原因,而脑白质是其主要损伤部位,其中的晚期少突胶质细胞前体(OPCs)是主要受损细胞。脑黄金DHA的主要成分(ω-3多不饱和脂肪酸, ω-3)对胎儿及婴儿的大脑特别脑白质的生长发育极为重要。但ω-3对HI所致脑瘫是否具有防治作用目前还不清楚,深入探究其在HI脑白质损伤中的作用,对新生儿脑瘫的及时干预有着重要意义。 【设计思路】 体外观察ω-3对培养OPCs缺氧条件下增殖、分化和凋亡等的作用;体内观察ω-3对HI模型脑白质损伤及动物行为学的影响,得出ω-3对新生儿HI所致脑瘫的防治作用。 【实验内容】 (1)ω-3对缺氧后OPCs的作用:体外培养OPCs,制作缺糖缺氧(OGD)模型,给予ω-3预处理以及缺氧后给药,LDH和MTT检测细胞受损和活性,BrdU、Ki67和PCNA免疫荧光观察细胞增殖,TUNEL染色显示细胞凋亡,免疫荧光、蛋白质印迹和q-PCR检测细胞PDGFR-α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和MBP等少突胶质细胞相关蛋白和mRNA的表达。(2)ω-3对缺氧后脑白质损伤的影响:制备新生大鼠HI模型,预给予或缺氧后补充ω-3,不同时相点取材,免疫荧光、蛋白质印迹和q-PCR检测脑白质中PDGFR-α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和MBP等少突胶质细胞相关蛋白和mRNA的表达,快蓝和Fluomeylin染色显示白质髓鞘的情况,BrdU、Ki67和PCNA免疫荧光染色检测细胞的增殖,TUNEL染色显示细胞的凋亡。(3)ω-3对缺氧模型大鼠成年后行为学的影响:应用旷场、斜杆、Y迷宫和Morris水迷宫等行为学测试,检测模型鼠成年后的运动能力和学习记忆能力。取材观察大脑重量、大脑的白、灰质分布以及神经反射速度。 【材料】 新生大鼠、缺氧罐、ω-3、各种细胞培养、分子生物学和免疫组织化学试剂。 【可行性】 以前研究表明ω-3对创伤后脑白质损伤具有保护作用,因此有理由推测ω-3对缺氧造成的脑白质损伤及少突胶质细胞损伤具有防护作用;指导教师一直进行脑缺氧方面的研究,可以提供指导和帮助。 【创新性】 本项目创新将ω-3引入新生儿脑瘫的防治研究,以期为HI性脑损伤的防治提供新措施。     

芳香烃受体(Ahr)蛋白介导类风湿关节炎(RA)骨破坏机制研究的实验设计

【立论依据】 近年发现,芳香烃受体蛋白(Aryl hydrocarbon receptor, Ahr)与RA骨破坏密切相关,可能成为RA的潜在治疗靶点。 【设计思路】 Wnt信号通路是成骨分化成熟的必需信号,干扰Wnt信号通路可显著抑制成骨。我们的前期实验结果显示升高的Ahr抑制了成骨细胞的分化发育和功能。为此,我们推测Ahr的内源性配体可能会拮抗Wnt蛋白与受体的结合;或Ahr作为胞内蛋白可能会促进β-catenin磷酸化降解;以及Ahr入核后可能直接或通过抑制Wnt信号通路而间接抑制成骨的靶基因转录,最终导致RA骨破坏。 【实验内容】 本实验将通过测定关节炎小鼠Ahr活化后成骨细胞分化成熟中各期标志性分子表达量的变化,明确Ahr活化对关节炎小鼠成骨细胞分化、发育和功能的抑制作用;通过测定Ahr活化后各期成骨细胞相关转录因子表达量的变化,明确Ahr活化对关节炎小鼠各期成骨细胞转录因子的抑制作用;通过测定Ahr活化后各期成骨细胞Wnt信号通路相关分子表达量的变化,探讨Ahr抑制Wnt信号通路分子降低成骨的机制;最后通过体内实验评估Ahr对关节炎骨破坏的影响。 【材料】 胶原诱导关节炎小鼠,分离的小鼠骨髓间充质干细胞,Ahr激动剂(TCDD)和抑制剂(DIM),real-time PCR、蛋白质印迹、免疫化学染色、流式细胞术、MTT、CHIP等实验方法中需要的各种试剂及设备。 【可行性】 相关文献显示Ahr激动剂可抑制成骨细胞分化发育,拮抗Ahr可改善关节炎症状,这为深入研究提供了理论依据;我们的前期结果显示RA模型鼠关节成骨细胞高表达Ahr;Ahr表达量与骨密度负相关,原代培养关节炎小鼠成骨细胞的成熟度下降,这为本实验设计提供了数据支持。 【创新性】 本实验的设计理念是依据目前对Ahr与自身免疫病的研究进展及RA骨破坏病理改变机制的最新认识,即Ahr与RA骨破坏密切相关;本实验设计的科研假说是通过文献汇总提出的,具有一定原始创新性,即Ahr直接或干扰Wnt信号通路促进骨破坏;本实验设计如能获得预期结果,可能为RA骨破坏新机制的揭示提供实验数据,也可为同时抑制炎症和骨破坏的RA防治理念提供新靶标。     

布地奈德雾化吸入对慢性哮喘所致小鼠脑内神经炎症的影响及作用机制

【立论依据】 慢性哮喘是一类呼吸系统慢性炎症性疾病,糖皮质激素雾化吸入是目前治疗慢性哮喘的首选药物。来自临床的零星研究提示,哮喘引起的间歇性缺氧和气道炎症可能会对脑组织产生不利影响。因而推测哮喘引起的外周炎症可能导致中枢神经系统的病理改变。因此,本文工作拟通过建立慢性哮喘小鼠模型,研究慢性哮喘和布地奈德雾化吸入对小鼠脑内炎症的影响并探讨其作用机制。 【设计思路】 建立慢性恶化性哮喘模型、予以布地奈德雾化吸入治疗,观察哮喘及激素治疗对成年小鼠脑内的神经炎症的影响,并探讨其作用机制。 【实验内容】 成年小鼠第0天和第14天两次腹腔注射卵白蛋白(ovalbumin, ova)致敏剂溶液(10 g ova和1 mg氢氧化铝粉末溶于0.2 mL生理盐水中)。第21天开始在雾化吸入箱(30 cm×18 cm×13 cm)内予以1% ova激发刺激,隔天1次,每次激发30分钟。每隔8次普通激发,用10% ova恶化激发一次(共三次),共激发29次。治疗组小鼠激发后用0.5 mg/mL的布地奈德雾化吸入治疗。检测肺部病理变化和动物肺泡灌洗液中TNFα、IL-1β,以验证慢性哮喘模型是否造型成功;应用免疫组织化学法检测小鼠海马和皮层神经元中神经元数目来研究慢性哮喘及布地奈德雾化吸入治疗对脑损伤的影响;观察脑内小胶质细胞的增殖活化、检测脑内皮层和海马组织中TNFα、IL-1β、TGFβ、IL-10等炎症因子水平,研究小鼠脑内炎症反应;应用蛋白质印迹方法检测脑内NF-κB/p65及TLR4的表达等探讨相关机制。 【材料】 2个月龄雌性BALB/c小鼠,雾化吸入箱,免疫组化及分子生物学实验等相关试剂。 【可行性】 立论依据充分,且有较好的前期研究基础。 【创新性】 揭示慢性哮喘导致成年小鼠脑内的神经炎症;阐明布地奈德雾化吸入通过抑制TLR4-p65/NFκB信号通路改善哮喘所致的神经损伤。     

左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用及基于Rho/ROCK信号通路改善足细胞损伤的影响

【立论依据】 观察左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病(DN)小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白及Rho、ROCK蛋白表达的影响研究左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用及基于Rho/ROCK信号通路改善足细胞损伤的影响。 【设计思路】 MKR转基因2型糖尿病小鼠给予高脂饮食联合右侧肾切除建立糖尿病肾病模型。观察左归降糖益肾方对DN小鼠血糖、肾功能及Rho、ROCK蛋白表达等的影响研究其是否具有保护DN肾脏的作用及是否通过抑制Rho／ROCK信号通路改善足细胞损伤。 【实验内容】 8周龄MKR小鼠50只随机分为5组,空白组(A组)、DN组(B组)、DN＋左归降糖益肾方组(C组)、DN＋Rho/ROCK信号通路抑制剂Y-27632组(D组)、DN＋糖适平＋贝那普利组(E组)。B、C、D、E组给予高脂饮食联合右侧肾切除造模。手术后2周开始给药。C组小鼠给予中药提取液灌胃治疗30 d。D组小鼠给予Y-27632腹腔注射15 d(隔天注射)。E组给予糖适平＋贝那普利灌胃治疗30 d。A、B组则以等体积蒸馏水灌胃。30 d后处死小鼠。电化学法检测小鼠空腹血糖,全自动生化仪检测尿素氮、血肌酐,ELISA法测定尿微量白蛋白,免疫组化及蛋白质印迹法测定肾脏组织Rho、ROCK蛋白表达,光镜观察肾小球形态结构,电镜观观察足细胞形态结构。 【材料】 MKR小鼠、左归降糖益肾方、贝那普利、糖适平、Y-27632、高脂饲料等。 【可行性】 课题组前期研究表明高脂饮食联合右侧肾切除的MKR转基因2型糖尿病小鼠是良好的糖尿病肾病模型;左归降糖益肾方具有改善糖尿病肾病的作用。国内外研究中均表明抑制Rho／ROCK信号通路具有保护糖尿病肾脏的作用。故本实验基于Rho／ROCK信号通路研究左归降糖益肾方对糖尿病肾病的作用机制具有可行性。 【创新性】 (1)MKR转基因2型糖尿病小鼠给予高脂饮食联合右侧肾切除建立糖尿病肾病模型。(2)近年来研究发现Rho／ROCK信号通路在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用。本实验基于Rho／ROCK信号通路探讨左归降糖益肾方对糖尿病肾病足细胞损伤的影响。     

维生素A对小鼠肝再生的作用及其作用机制探索

肝细胞具有很强再生能力,视黄醇对于肝再生的作用目前还没有定论。通过几条途径,推测维A可能促进肝再生。在术前采用视黄醇灌胃探索其对肝再生的作用及其可能机制。【立论依据】 肝细胞具有很强的再生能力,而一些物质能够诱导肝细胞再生的加强。视黄醇能够促进肝细胞再生可能通过两个途径:一是视黄醇是ADH的底物之一,而氧化产生的视黄醛又是ALDH的底物之一。饲喂视黄醇可能能够诱导肝细胞ALDH活性的增强,从而避免肝切产生的胞内脂肪醛类物质对于肝细胞的损伤;二是视黄醇的代谢产物视磺酸可以促进一系列与细胞分裂分化相关的基因的表达,从而促进肝细胞再生。 【设计思路】 在小鼠肝切术前给予维生素A刺激,与对照组对比,检测维A对于小鼠肝再生是否有作用,并在此基础上进一步探索相关可能的机制。 【实验内容】 取6-8周雄性小鼠分为六组:A-C组在术前24、48、72 h进行视黄醇灌胃处理,D-F组在同样时间用大豆油灌胃。A、D组术前另外腹腔注射ALDH2拮抗剂Daizin。B、E组术前另外腹腔注射ALDH2激动剂alda-1。50%肝切。在术后48、96、144 h分别处死一批小鼠,测量残肝重、ALDH2活性、血清转氨酶浓度等指标检测肝脏的再生情况。 【材料】 动物:C57 6-8周小黑鼠;器械:小动物手术器械;小鼠胃灌流器、纱布,酒精棉球;鼠笼,鼠粮,鼠板;1.5 mL ep管;试剂:戊巴比妥钠;酒精;全反式视黄醇(维生素A);生理盐水;Daizin(ALDH2拮抗剂);alda-1(ALDH2激动剂) 【可行性】 纵观整个实验,最大的困难在于肝切术的实现。对此,进行了预实验。选择小鼠左前叶和左中叶,进行肝叶蒂部结扎50%肝切除。经过多次手术操作观察,目前手术成功率高,确立了手术的可操作性。而其余的操作都比较容易实现。 【创新性】 大多数研究都是关于药物长期处理对于肝脏的影响,很少有关于急性大剂量药物处理对于肝再生影响的研究。另外,、视黄醇能否通过激活ALDH2来促进肝脏再生的机制也是首次验证。     

清开灵和双黄连口服液体内抗禽流感病毒作用

目的 评价清开灵和双黄连口服液体内抗禽流感病毒药效,探讨其对感染流感病毒小鼠免疫功能的影响。方法 建立H9N2亚型禽流感病毒鼠肺适应株人工感染BALB/c小鼠模型,以肺指数抑制率、生命保护率和肺病毒滴度为主要评价指标,研究清开灵和双黄连口服液对感染H9N2亚型禽流感病毒小鼠的防治效果;以脾指数、胸腺指数和T细胞亚群比率（CD4⁺/CD8⁺）为主要评价指标,探讨清开灵和双黄连口服液对感染流感病毒小鼠免疫功能的影响。结果 清开灵和双黄连口服液均能显著抑制H9N2亚型禽流感病毒引起的小鼠肺炎实变,攻毒后第4天小鼠肺指数抑制率分别为34.1%、26.3%。清开灵和双黄连口服液对感染小鼠有显著的生命保护作用,存活率分别为70.0%、60.0%,显著高于病毒对照组的存活率（30.0%）,鼠肺病毒滴度显著低于病毒组（P＜0.01）。清开灵和双黄连口服液对感染病毒后小鼠脾脏和胸腺萎缩具有显著的抑制作用,并能提升感染小鼠脾脏中CD4⁺/CD8⁺值。结论 清开灵和双黄连口服液具有显著的抗禽流感病毒作用,对病毒复制的抑制及对病毒感染导致的小鼠免疫功能下降的调节作用是其发挥抗病毒功效的重要机制。