医务人员粪便中大肠杆菌R质粒指纹图分析

本文通过对115株大肠杆菌碉耐药谱、R质粒接合传递、质粒凝胶电泳图及内切酶图谱等综合分析，探讨了指纹图谱分析在R质粒流行病学研究中的意义。115株大肠杆菌中有105株为耐药株，其中75株为多重耐药、30株为单一耐药、接合性R质粒检出率在多重耐药株中占70．66％，在单一耐药株中为36．7％。质粒凝胶电泳结果表明，所有耐药株都带有可传递的接合性质粒，酶切图结果显示，耐药性相同的R质粒径内切酶作用后出现相同的质粒DNA片段，表明具有高度同源性。     

双复制子质粒消除耐药质粒的研究

目的观察双复制子质粒对耐药质粒的消除作用。方法构建双复制子质粒pKT230-oriV,并通过转化或接合转移途径转入带有pRK290质粒的细菌中,观察双复制子质粒对耐药质粒的消除作用。结果转入双复制子质粒菌培养5代后,细菌中的pRK290耐药质粒被消除。结论双复制子利用接合转移途径是消除耐药质粒的一个途径。     

医务人员粪便中大肠杆菌R质粒指纹图分析

本文通过对115株大肠杆菌碉耐药谱、R质粒接合传递、质粒凝胶电泳图及内切酶图谱等综合分析,探讨了指纹图谱分析在R质粒流行病学研究中的意义。115株大肠杆菌中有105株为耐药株,其中75株为多重耐药、30株为单一耐药。接合性R质粒检出率在多重耐药株中占70.66％,在单一耐药株中为36.7％。质粒凝胶电泳结果表明,所有耐药株都带有可传递的接合性质粒,酶切图结果显示,耐药性相同的R质粒经内切酶作用后出现相同的质粒DAN片段,表明具有高度同源性。     

survivin特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的 构建survivin基因的RNAi真核表达载体并观察其对转染腺样囊性癌细胞株ACC-2后survivin表达变化以及对细胞凋亡的影响.方法 设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-2细胞株.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染后的ACC-2细胞中survivin mRNA表达的变化,用TUNEL检测细胞凋亡的变化.结果 经测序模版序列和设计序列完全正确,在pGenesil-shRNA-survivin转载ACC-2细胞株中,survivin mRNA表达明显降低,转染的ACC-2细胞凋亡显著增加.结论 成功构建了survivin基因的RNAi真核表达载体,且其对腺样囊性癌细胞有一定的干扰效果.     

提取结核分支杆菌质粒的初步探讨

目的 :研究结核分支杆菌耐药性与质粒的关系。方法 :对 1 1株耐药结核分支杆菌采用经典的碱裂解法提取质粒。结果 :1 1株结核分支杆菌均未提取出质粒。结论 :迄今为止国内外均未提取出结核分支杆菌质粒 ,在此对结核分支杆菌是否具有质粒、质粒类型及耐药性机理进行讨论     

质粒的制备

随着人类基因组计划的顺利进行 ,一个更为广阔且具活力和应用前景的研究领域人类基因组后计划已形成 ,并吸引全世界顶尖科学家和实验室参与。人类基因组后计划的研究内容主要涉及功能基因的分离、鉴定 ,其编码蛋白质的生物学功能及其可应用研究。本领域所采用的研究方法主要包括分子生物学、蛋白质组学和功能蛋白质学等实验方法。其中 ,分子生物学常用实验方法在研究中使用最广 ,可变性最大 ,且可选择最多。为提高我校广大科学研究者对分子生物学技术和实验方法有一较全面的了解和知晓本校可用的资源 ,特邀请本校分子生物学中心试验室根据其研究工作撰写有关分子生物学常用实验方法的介绍 ,并陆续在本刊上发表 ,供大家参考     

产KPC酶超耐药阿斯肠杆菌EaH7的发现及其耐药伴生质粒的遗传特征

 目的  分析1株亚胺培南抗性阿斯肠杆菌(Enterobacter asburiae)的耐药机制及其遗传特征。方法  Vitek-2 Compact系统初步鉴定菌株并测定抗生素最小抑菌浓度,对16s rRNA基因测序以确定菌株;PCR法扩增β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等17种耐药基因并测序确认;以CaCl₂诱导的化学法转化质粒;构建伴生质粒DNA文库并测序,以Glimmer 3.02 和BLASTP软件注释并预测伴生质粒序列的编码基因功能;采用接合试验验证伴生质粒对耐药性质粒转移的作用。结果  该菌株为阿斯肠杆菌,对亚胺培南等15种β-内酰胺及氨基糖苷类抗生素耐药,仅对左氧氟沙星和环丙沙星敏感;该菌株同时含有2种质粒,其中耐药性质粒pEa-1携带耐药基因blaKPC-2、blaCTX-M-15和blaTEM-1,而伴生质粒pEa-2则携带4种转移蛋白基因mobA、mobB、mobC和mobD;pEa-2可促进耐药质粒pEa-1接合转移。结论  在国内首次报道了产KPC-2酶的阿斯肠杆菌,该菌携带的质粒pEa-2具有促进耐药性质粒pEa-1接合转移的作用。     

质粒重组体构建中连接,转化时间的探讨

探讨质粒重组体构建中，重组体连接反应的时间对转化与基因克隆结果的影响。方法，Ｃ ＥＢＶＢＨＲ１基因与ＰＢＶ２２１载体的妆为研究对象，对连反应在３ｈ、６ｈ、１２、２４ｈ４个时段连接液的转化效果进行研究。     

改良的碱裂解法提取动物细胞附加体DNA

目的 利用一种快速、简便的方法 提取动物细胞附加体DNA.方法 通过电转移的方法介导pEGFP-N1转染小鼠成纤维细胞NIH3T3和中国仓鼠卵巢癌细胞CHO等细胞系.转染后48 h,收集转染细胞.用STET缓冲液重悬细胞,加入碱裂解液裂解细胞,再用7.5 mol/L醋酸胺中和.离心收集上清,用1∶1酚/氯仿抽提2次,氯仿抽提1次,乙醇沉淀附加体DNA.TE溶解DNA.提取的DNA通过PCR和southern blot方法进行分析.结果 PCR和Southem blot结果证实利用改良的碱裂解法可以从动物细胞提取附加体DNA.结论 利用简便快速的碱裂解法可以提取哺乳动物细胞附加体DNA.     

大质粒的检测方法

大质粒一般指具有传递性功能的质粒,其大小至少在15Mu以上,位于琼脂糖凝胶电泳图谱染色体带的上方,多数为40Mu以上。目前发现的最大质粒为350Mu。大质粒存在于许多种细菌中,构成了宿主菌全部遗传基因不可忽视的一部分。质粒分子量越大,其结构和分子特性就越与染色体相似,应用根据质粒与染色体分子特性不同而设计的分离质粒DNA的方法很难检测出较大质粒。因此,大质粒的检测就成为质粒工作者所面临的新课题。关于细菌质粒的检测方法,我们曾做过较为详细的介绍,本     

细菌质粒检测方法研究进展

质粒(Plasmid)是存在于细菌染色体外的能够独立进行复制的复制子,是双股环状的 DNA。质粒不是细菌生命活动所必需的物质,但对细菌的表型产生一定的影响。随着近代分子生物学和分子遗传学的迅速发展,质粒作为基因工程中的重要的分子载体越来越得到广泛的重视和应用。关于质粒的一般性质、结构、复制以及与致病性的关系,国内外学者已有较为详细的介绍,     

介绍一种简易、快速提取和纯化质粒的方法

我们报告一种简单、快速提取和纯化质粒的方法。经过细菌培养、质粒扩增制备出清亮裂解液,经酚处理后,用Sephacryl S—1000凝胶过滤层析除去了菌体RNA。制备出的高纯度质粒DNA可用于限制内切酶等分析与应用。     

表皮葡萄球菌污染对质粒转化和抽提影响的实验研究

目的：探讨导致部分质粒转化和抽提失败的原因，方法：使用同一批DH5－α细菌制备感受态，转化、碱裂解法抽提和鉴定两种质粒，经抗性LB琼脂平板筛选和菌落分析，对照成功抽提和鉴定的质粒，分析部分质粒反复转化和抽提失败的原因，结果：发现在该抽提失败的质粒所转化的抗性LB琼脂平板上存在两种菌落，大量白色菌落为表皮葡萄球菌，其过夜振摇产物经碱裂解法抽提质粒失败，极少数淡黄色菌落为大肠杆菌，经鉴定，质粒抽提成功，结论：隐蔽的表皮葡萄球菌污染可能是导致部分质粒反复抽提失败的重要原因。     

药物在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRsT98的研究

目的 探讨用中西药在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRST98的可能性。方法 将原存在于伤寒杆菌中的耐药质粒pRST98经接合转移分别导入大肠杆菌和鼠伤寒杆菌，选用双黄连和氧氟沙星对上述3种细菌进行亚抑菌浓度的消除试验，并对实验前后的受试菌分别进行K－B纸片扩散法和最小抑菌浓度法（MIC）药敏试验及质粒电泳检测。结果 两种药物在体外未能将受式菌携带的pRST98消除；但该质粒编码的耐药标志减少；部分菌株对原有药物的耐药程度明显下降。结论 双黄连和氧氟沙星能降低pRST98宿主菌的耐药性，但药物作用后同一质粒在不同宿主菌中耐药性变化的差异，显示该质粒表达的多样性和复杂性。     

鲍曼不动杆菌质粒指纹图谱分析及质粒与其耐药性关系的研究

目的监测鲍曼不动杆菌的院内感染状况,探讨质粒与其耐药之间的关系.方法用琼脂纸片扩散法(K-B法)测定鲍曼不动杆菌对14种抗生素的敏感性.微量碱裂解法快速提取质粒DNA,通过琼脂糖凝胶电泳获得质粒指纹图谱.对单质粒菌株采用质粒消除试验研究其与耐药性之间的关系.结果抗生素敏感性测试结果表明,大多数菌株显示出多重耐药性.71株临床分离株中有43株检测到质粒,根据质粒图谱可分为8个型别.质粒消除试验显示32.0 kb的质粒消除后耐药性无明显变化,22.0 kb的质粒消除后,该菌对部分抗菌药物的耐药性丢失.结论亚胺培南、舒普深和头孢吡肟具有较高的抗菌活性,可作为鲍曼不动杆菌感染的治疗药物.质粒指纹技术仍可作为院内感染流行病学调查的一种重要手段,其结果表明该院鲍曼不动杆菌感染呈散发的流行态势.22.0 kg的质粒与该菌对氨苄西林、哌拉西林、庆大霉素、阿米卡星的耐药性有关.     

穿俊质粒pZH32的构建

The shuttle vector can replicate in both bacteria and eukaryotic cells. We have constructed a shuttle vector pZH32 based on the EB virus. Three component parts of the plasmid come from pSV2gpt, pS189 and pMCi5. An E. coli tyrosine suppressor tRNA gene, supF, was used as a mutagenic target in this plasmid, and a gpt gene was used as a selectable marker gene for transformed cells. This pZH32 based on EBV replicates autonomously in the nuclei of human cells. It has a low background mutation frequency. The plasmid can be used to examine the mutagenic mechanism of potential mutagens and carcinogens in mammalian cells.     

pRIT—5质粒转化枯草杆菌及地衣芽孢杆菌NM105的研究

迄今文献中报道枯草杆菌基因克隆化都采用枯草杆菌１６８例及其突变体。采用我国分离的枯草杆菌Ｋｉ－２及突变体Ｋｉ－２－１３２ｔ ｆ ｙｅ ａａｈ ＃猓瘢? ｓｆｈ ａｌｔ ＮＭ１０５ｏ ＰＲＩＴ－５ｒｆｍ ｏｕｇ ＤＮＡｒ ｅｐｃ ｗｓｇ ａｌ? ｓｒｉ ，ｅｔ