DNA印迹试验

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术,又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA,或经PCR获得扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳,所得的DNA片段按分子大小分离,DNA片段经琼脂糖凝胶、变性,并将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上(多为硝酸纤维素膜,NC或尼龙膜),     

全反式维甲酸及其衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对A549细胞增殖和OPN表达的影响

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)及其新型衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)对人肺腺癌细胞株A549增殖和骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其相关性.方法 以A549细胞株为研究对象,分别予以不同浓度的ATRA及ATPR进行干预,应用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定A549细胞的增殖情况;Western...     

骨桥蛋白和P21在原发性肝癌中的表达及其临床意义

目的　探讨骨桥蛋白(OPN)和P2 1在原发性肝癌组织中的表达及它们在肝癌转移中的作用。方法　采用免疫组化S P法检测69例原发性肝癌组织中OPN和P2 1的表达情况。结果　①OPN和P2 1的阳性表达主要定位于癌细胞的细胞浆;OPN、P2 1在69例肝癌组织中阳性表达率分别为72 .5 % (5 0 / 69)和62 .3 % (4 3 / 69)。②在发生转移的肝癌组织中OPN和P2 1阳性表达率分别为84.2 % (3 2 / 3 8)和76.3 % (2 9/ 3 8) ,高于无转移的肝癌组织中OPN(5 8.1% ,18/ 3 1)和P2 1(4 5 .2 % ,14 / 3 1)阳性表达率,差异具有显著性,P <0 .0 5。③两者均阳性表达的3 5例肝癌中有2 4例(74.3 % )已发生转移,与两者均阴性表达的11例肝癌中仅有1例(9.1% )发生转移比较差异有显著性,P <0 .0 5 ,提示OPN和P2 1均阳性表达与肿瘤转移的发生密切相关。④OPN和P2 1的表达与肿瘤的大小、AFP水平、有无HBV感染、肿瘤分化、性别、年龄等因素无关,但与肿瘤侵袭转移的发生有关,P <0 .0 5。⑤OPN和P2 1的表达呈显著正相关(r =0 .2 5 7,P <0 .0 5 )。结论　OPN和P2 1的表达与肝癌侵袭转移的发生有密切关系,两者均阳性表达时对预测肝癌已发生转移具有指导意义。     

褪黑素通过 ERK/MAPK 通路调控 AS 兔动脉内皮细胞 MLCK 表达

 目的 探讨褪黑素（ melatonin ， MLT ）是否可通过信号调节激酶 / 丝裂原活化蛋白激酶（ ERK/MAPK ）通路调控动脉粥样硬化（ atherosclerosis ， AS ）模型兔动脉内皮细胞肌球蛋白轻链激酶（ myosin light chain kinase ， MLCK ）的表达。 方法 复制兔 AS 模型，分析血清中相关脂质成分的动态变化；γ -³²P-ATP 掺入法测定模型兔主动脉的 MLCK 活性；动脉经冰冻切片，免疫组化检测动脉内膜 MLCK 的表达，伊红（ HE ）染色观察动脉壁的形态结构； Western blot 检测 AS 兔动脉组织 MLCK 的表达和 ERK 磷酸化水平。 结果 AS 兔模型复制成功，实验兔在高胆固醇（ cholesterol ， Cho ）饮食 4 ， 8 ， 12 周后，与正常对照相比，血清中相关生化指标有逐渐增加趋势（ <> P <0.05 ）；γ -³²P-ATP 掺入法显示动脉组织中 MLCK 的活性呈逐渐增强趋势（ <> P <0.05 ）， Western blot 和免疫组化则显示动脉内皮细胞 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平亦呈逐渐增强趋势， HE 染色显示主动脉内膜逐渐增厚，细胞间隙逐渐增大；而加喂 MLT 后，动脉组织 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平及 MLCK 的活性和主动脉内膜通透性均有所下降，而泡沫细胞形成量逐渐增多，至高 Cho 饮食 12 周时则形成了明显的 AS 斑块，加喂 MLT 后，主动脉内膜病变则有一定程度减轻。 结论 MLT 可能通过 ERK/MAPK 通路下调模型兔动脉内皮细胞 MLCK 活性而减轻 AS 斑块的病变程度。     

多聚酶链反应-单链构象多态性分析基因点突变

单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)是一种简便、敏感有效的鉴定扩增DNA序列变化的技术.相同长度的单链DNA因其序列不同(甚至单个碱基不同),形成的构象相异,电泳时泳动速度不一.PCR产物经变性后进行单链DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳时,靶DNA中若有单个碱基替换等改变时,会出现泳动变位(mobility shift).PCR-SSCP的最主要优点是简单,在不同的系统中突变检出率达70%～95%以上,其主要不足可能是漏检一些突变.作者根据本实验室对多抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)p53突变的检测,介绍PCR-SSCP的实验过程.     

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡分化的影响

目的 研究新合成的全反式维甲酸(ATRA)衍生物(4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯)对人肝癌细胞株HepG2体外增殖、凋亡及分化情况的影响.方法 3种浓度(1、5、10 μmol/L)的ATRA衍生物分别处理HepG2细胞,1、2、3、7d后用MTT法检测4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对HepG2细胞增殖的影响;酶动力学法检测γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)比活性和甲胎蛋白(AFP)分泌量变化;流式细胞术分析细胞周期及凋亡情况;Western blot检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达量.结果 10 μmol/L的4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯可明显诱导HepG2细胞凋亡,凋亡率达到49%,并且使代表肝细胞恶变的γ-GT比活性、AFP分泌量明显下降,Western blot显示4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯显著抑制Bcl-2、Bcl-xS/L和p-Erk表达.结论 4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯是肝癌细胞HepG2有效的分化诱导剂,并明显促进肝癌细胞凋亡.     

肺癌患者血清肿瘤标记物检测的临床意义及预后评估

目的评估血清癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)和特异性烯醇化酶(NSE)水平在肺癌诊断中的价值,探讨三项肿瘤标记物血清水平与患者临床特征、化疗疗效和预后的关系。方法采用化学发光法检测227例肺癌患者和60例肺良性疾病患者血清中CEA、CYFRA21-1、NSE含量,同时收集患者完整的临床资料,随访患者无进展生存时间(PFS),使用SPSS17.0软件对所得数据进行统计分析。结果 1肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE水平明显高于肺良性疾病组(P0.01);CEA、CYFRA21-1、NSE的ROC曲线下面积分别是0.8、0.6、0.8,均大于0.5。腺癌、鳞癌、小细胞肺癌分别以CEA、CYFRA21-1、NSE检测灵敏度最高(P0.01)。三项肿瘤标记物联合检测较单项检测诊断灵敏度显著提高。2与I+II期患者比较,IV期肺癌患者CEA、CYFRA21-1、NSE水平明显升高(P0.05);胸外转移组三项肿瘤标记物均显著高于无转移组(P0.05)。3疾病进展(PD)组患者的治疗前血清CYFRA21-1、NSE水平明显高于疾病控制(DC)组(P0.05)。4治疗前血清CYFRA21-1、NSE水平正常的患者PFS明显长于升高者(P0.05)。结论血清CEA、CYFRA21-1和NSE检测有助于肺癌的诊断,联合检测更优,且对鉴别肺癌与肺部良性疾病、有无转移的评价及肺癌不同病理类型和分期有一定的参考价值;同时,治疗前CYFRA21-1和NSE血清水平可以评估肺癌的预后,观察治疗效果。     

肺动脉粥样硬化兔肺动脉壁骨桥蛋白表达的变化

目的探讨肺动脉粥样硬化模型兔肺动脉壁骨桥蛋白(OPN)表达的变化。方法 24只新西兰兔,随机平均分为正常对照组和高脂模型组,分别给予基础饲料和高脂饲料(基础饲料+1%胆固醇+5%猪油)喂养12周后取血和肺动脉,分析血清中相关脂质成分的变化;HE染色观察肺动脉壁的形态结构;免疫组化法和Western blot检测肺动脉粥样硬化兔肺动脉壁OPN的表达。结果成功建立肺动脉粥样硬化兔模型,高脂模型组在高脂饮食12周后,与正常对照组比较,血清中甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)有明显增加(P<0.05),其中以LDL和LDL/HDL比值升高最明显;HE染色显示高脂模型组肺动脉内膜增厚,细胞间隙逐渐增大,泡沫细胞形成,可见明显的动脉粥样硬化斑块;免疫组化法和Western blot显示高脂模型组肺动脉壁OPN的表达较正常对照组显著增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高脂饮食可导致肺动脉粥样硬化形成,OPN在肺动脉粥样硬化斑块形成中起重要的作用。     

全反式维甲酸对人胃癌细胞株caveolin-1表达和定位的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对人胃癌细胞株SGC7901的增殖及对胞膜蛋白caveolin-1表达和定位的影响。方法 MTT法检测不同浓度(5、10、25μmol/L)ATRA对SGC7901细胞增殖的影响;免疫荧光法检测cavolin-1在细胞中的定位,Western blot检测caveolin-1的表达。结果 ATRA可明显抑制人胃癌细胞株SGC7901的增殖。ATRA处理3 d后,SGC7901细胞caveolin-1的表达无明显变化,但caveolin-1在胞浆中的分布明显降低,胞膜上分布明显增加。结论 ATRA可明显抑制SGC7901的增殖,促进caveolin-1在细胞膜上定位。     

人非肌肉肌球蛋白轻链激酶N端表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建人非肌肉肌球蛋白轻链激酶(hnmMLCK)N端表达载体及其体外表达与表达产物的纯化。方法：用PCR方法扩增hnmMLCK的N端cDNA ,插入质粒pBKcmv中的构建成表达载体，转化入大肠杆菌XL1-blue，经IPTG诱导表达，表达产物用电洗脱的方法初步纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为hnmMLCK重组质粒，SDS－PAGE证实获得分子量为21ku的融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21％。结论：成功构建了重组hnmMLCK表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究及临床应用奠定了良好基础。