鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力与基因型关系的研究

目的 研究鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力与基因型的关系.方法 采用组织平板法对42株鲍曼不动杆菌临床分离株的生物被膜形成能力进行半定量检测,并以肠杆菌基因间重复序列为引物的聚合酶链反应(enter-obacterial repetitive consensus PCR,ERIC-PCR)技术对其进行基因分型.结果 42株...     

溶原性噬菌体对铜绿假单胞茵生物被膜形成的影响

目的 研究铜绿假单胞菌(PA3094)溶原性噬菌体Ppa3094对该菌生物被膜形成的影响.方法 采用平板培养法建立PA3094及PA3094-L(带前噬菌体Ppa3094的溶原性菌株)两株菌的体外生物被膜模型;MTT法测定生物被膜形成过程中两株菌的生物被膜活菌量;实时荧光定量PCR测定两株菌在培养不同时间点藻酸盐合成基因algC、algD的表达量.结果 两株菌均在培养5～7 d时形成成熟的生物被膜,呈薄膜状.在生物被膜形成过程中,两株菌的生物被膜菌量存在明显差异,在整个生物被膜形成过程中,PA3094生物被膜菌量均比PA3094-L高,PA3094-L在培养第5 d时生物被膜菌量达最高,第7 d有所下降.随着培养时间的延长,藻酸盐合成基因algD、algC表达量均上调,但PA3094-L表达量均比PA3094低,且algC表达量差异更大.结论 铜绿假单胞菌溶原性噬菌体Ppa3094可降低藻酸盐合成基因algD、algC的表达,从而影响生物被膜的形成.     

溶原性噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的研究铜绿假单胞菌（PA3094）溶原性噬菌体Ppa3094对该菌生物被膜形成的影响。方法采用平板培养法建立PA3094及PA3094-L（带前噬菌体Ppa3094的溶原性菌株）两株菌的体外生物被膜模型;MTT法测定生物被膜形成过程中两株菌的生物被膜活菌量;实时荧光定量PCR测定两株菌在培养不同时间点藻酸盐合成基因MgC、algD的表达量。结果两株菌均在培养5～7d时形成成熟的生物被膜,呈薄膜状。在生物被膜形成过程中,两株菌的生物被膜菌量存在明显差异,在整个生物被膜形成过程中,PA3094生物被膜菌量均比PA3094-L高;PA3094-L在培养第5d时生物被膜菌量达最高,第7d有所下降。随着培养时间的延长,藻酸盐合成基因algD、algC表达量均上调,但PA3094-L表达量均比PA3094低,且algC表达量差异更大。结论铜绿假单胞菌溶原性噬菌体Ppa3094可降低藻酸盐合成基因algD、algC的表达,从而影响生物被膜的形成。     

铜绿假单胞菌泳动、蹭行能力及Ⅲ型分泌系统与成膜能力的关系

目的：探讨铜绿假单胞菌（PA）泳动及蹭行能力对生物被膜形成的影响,并分析不同成膜能力PA菌株Ⅲ型分泌系统毒力基因差异。方法：收集中南大学湘雅医院临床分离的非重复PA 192株,96孔板法检测菌株成膜能力,平板法检测菌株的泳动及蹭行能力,聚合酶链反应检测Ⅲ型分泌系统毒力基因。结果：192株PA临床分离株中186株（96.9%）具有成膜能力,其中弱成膜36株,中等成膜84株,强成膜66株。不成膜、弱成膜、中等成膜、强成膜组泳动环直径分别为（9.12±6.76）、（18.42±7.51）、（19.10±4.77）、（17.80±5.27）mm;各组蹭行环直径分别为（8.38±1.50）、（17.21±7.42）、（18.49±5.62）、（20.44±6.43）mm,不成膜组泳动和蹭行能力均弱于各成膜组,差异具有统计学意义（均P<0.05）。192株PA中,exoS、exoU、exoY和exoT阳性分别为163株（84.9%）、40株（20.8%）、183株（95.3%）和189株（98.4%）。不同成膜能力PA毒力基因exoS、exoU、exoT阳性率不同,差异具有统计学意义（P<0.05）。其中强成膜组exoS阳性率低于中等成膜组（χ²=9.293,P<0.01）和弱成膜组（χ²=9.997,P<0.01）;强成膜组exoU阳性率高于弱成膜组（χ²=10.803,P<0.01）。结论：中南大学湘雅医院临床分离的铜绿假单胞菌多具有生物被膜形成能力;泳动、蹭行能力与是否形成生物被膜相关,而与成膜能力强弱相关不明显;Ⅲ型分泌系统毒力基因与生物被膜形成能力可能相关。     

STR基因座D1S518、D4S2639、D15S817汉族人群遗传多态性调查

目的分析武汉地区汉族人群D1S518、D4S2639、D15S8173个短串联重复序列（STR）基因座遗传多态性，探讨其在法医学检验中的应用价值。方法应用PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带等技术，对各样品进行3个STR基因座分型，调查武汉地区汉族人群3个STR基因座遗传多态性基因频率分布。结果D1S518基因座观察到8个等位基因，24个基因型；D4S2639基因座观察到9个等位基因，32个基因型；D15s817基因座观察到7个等位基因，18个基因型，3个STR基因座的杂合度分别为0．7547、0．8165、0．7602；多态性信息含量分别为0．7290、0．7568、0．7222。结论DIS518、D4S2639、D15S8173个STR基因座基因频率分布与Hardy-Weinberg平衡吻合良好，在武汉地区汉族人群中呈现较高的遗传多态性，属于高信息度遗传标记。     

蹭行运动和胞外藻酸盐在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用

目的 比较3株铜绿假单胞菌即含新的mucA基因突变的黏液型PA17、mucA基因经典突变的黏液型PD0300、含野生型mucA基因的非黏液型PA01生物被膜早期形成和成熟形态,探讨铜绿假单胞菌纤毛介导的蹭行运动和胞外基质藻酸盐在黏液型及非黏液型铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 用PAl7、PAO1、PD0300的单菌落穿刺接种1%琼脂糖平板,肉眼观察细菌纤毛介导的蹭行运动,测定细菌运动环评估3株细菌的蹭行运动能力;在生物被膜形成早期采用结晶紫对膜内黏附细菌染色,测定其吸光度(A)值,建立24 h内3株细菌的黏附曲线;建立未饱和铜绿假单胞菌生物被膜模型,检测早期和成熟期的胞外藻酸盐分泌;将含绿色荧光蛋白的pUCP/UV质粒转化3株铜绿假单胞菌,在激光共聚焦显微镜下观察静态生物被膜不同时期的形态和结构.结果 黏液型PA17、非黏液型PAO1菌株蹭行运动的直径小于黏液型PDO300(P<0.05),PA17、PAO1的运动能力弱于PDO300菌株;黏液型PDO300在早期生物被膜形成中黏附能力最强,非黏液型PAO1次之,黏液型PA17最弱;在未饱和生物被膜早期和成熟期黏液型菌株PA17、PDO300藻酸盐合成均明显高于非黏液型菌株PAO1(P<0.05),而PA17和PDO300在生物被膜相同时期的藻酸盐合成无明显差异(P>0.05);激光共聚焦显微镜下PA17菌株在生物被膜形成中,不可逆黏附形成明显迟于非黏液型PAO1和黏液型PDO300,PA17成熟生物被膜形态呈薄膜状,与非黏液型PAO1成熟生物被膜类似;而PDO300不可逆黏附形成早,成熟生物被膜形态呈蘑菇状.结论 纤毛介导的蹭行运动是早期生物被膜形成中黏附的重要方式,可能影响成熟生物被膜的形态;而藻酸盐不是早期黏附的主要决定因素,与成熟生物被膜形态无关.     

变形链球菌临床分离株乳酸脱氢酶遗传多态性研究

目的 探讨变链菌临床株（血清型C）乳酸脱氢酶基因多态性与细菌致龋力及酶活性的关系。方法 高龋组变链菌34株，无龋组变链菌36株；其中24株乳酸脱氢酶高活性，21株低活性。以细菌组DNA为模板扩增结构基因ldh，对目的基因进行限制性片段长度多态性分析（RFLP），并行测序分析。结果 MseⅠ酶切ldh—RFLP表现A、B两种基因型，而HphⅠ、MnlⅠ、DdeⅠ、NlaⅡ和AluⅠ消化扩增产物未发现多态。确切概率法单侧检验发现B基因型菌株在无龋组的检出高于高龋组（P〈0．05），双侧检验两种基因型在不同酶活性组的分布不同（P〈0．05），低活性组B基因型菌株的比例高于高活性组。测序证实特异碱基突变引起酶切位点改变而产生多基因型。结论 变链菌临床分离株乳酸脱氢酶基因较为保守，但仍存在碱基变异。研究提示乳酸脱氢酶基因多态性与酶活性差异相关，并可能在一定程度上与龋的低敏感性相关。     

外排泵抑制剂对泛耐药鲍曼不动杆菌生物被膜的影响

目的 了解泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR AB)生物被膜形成与外排泵基因表达的关系,比较4种外排泵抑制剂对泛耐药鲍曼不动杆菌生物被膜的作用.方法 1)微量肉汤稀释法测定4种外排泵抑制剂(EPIs)PAβN、奥美拉唑、维拉帕米、CCCP对9株泛耐药鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC);并分别测定9株XDR AB生物被膜形成前后对17种抗菌药物的耐药性变化情况.2)结晶紫染色法测定4种外排泵抑制剂对9株XDR AB生物被膜形成的影响.3)实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定9株XDR AB浮游状态与生物被膜状态下外排泵基因adeB、adeG、ade J的表达情况.结果 9株XDR AB除对替加环素、多黏菌素B敏感外,对其余抗菌药物均不同程度耐药.生物被膜状态比浮游状态的XDR AB对于抗菌药物的耐药性进一步增加(1～32倍).4种EPIs均能够抑制XDR AB生物被膜的形成,以PAβN的抑制作用最强(P<0.05).在生物被膜态下,9株XDR AB的外排泵基因adeB和ade J的表达量与浮游状态adeB和ade J的表达量比较明显增加(P<0.05).结论 XDR AB生物被膜状态比浮游状态耐药性进一步增强与部分外排泵基因的高表达相关;4种EPIs对XDR AB生物被膜的形成具有抑制作用.     

无乳链球菌对奥马环素的敏感性研究

目的 研究无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)对奥马环素(omadacycline,OMC)的药敏特点及其与生物被膜形成能力、耐药基因、毒力基因之间的关系。方法 收集深圳市南山区人民医院2015—2020年无乳链球菌临床分离株共136株，用微量肉汤稀释法测定这些菌株对OMC的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)，用结晶紫染色法检测无乳链球菌的生物膜，采用聚合酶链反应(PCR)方法检测耐药基因(tet M、tet O、tet K、erm B、Optr A)和毒力基因(cpsⅢ、bca、fbs A、cps A、scp B)。结果 136株临床分离的无乳链球菌中，对OMC耐药的有20株(14.7%)，中介有64株(47.1%)，敏感有52株(38.2%)；生物被膜阳性菌株有57株(41.9%)，对OMC敏感的有20株(35.1%)，生物被膜阴性菌株有79株(58.1%)，对OMC敏感的有32株(40.5%)，两组菌株敏感率之间差异有统计学意义(χ²=63.062,P<0.0...     

临床分离铜绿假单胞菌密度感应缺陷株致病性分析

目的以临床分离的铜绿假单胞菌(PA)为研究对象,从临床角度探讨密度感应(QS)在PA感染发病机制中的作用,为临床控制PA感染提供新的思路。方法采用刚果红弹性蛋白酶解实验对临床分离的84例PA株进行QS缺陷筛选,检测QS缺陷株的弹性蛋白酶表达、绿脓菌素分泌、生物被膜形成及泳动能力。结果在84例临床分离PA株中筛选出4例QS缺陷株(C39,C84,C104,C117),检出率为4.76%。PCR检测显示:C84的rhl Ⅰ、rhl R基因缺失。序列检测发现:C39 rhl Ⅰ基因序列多个位点碱基突变,其中第184、249位碱基突变导致编码蛋白62、83位氨基酸由丝氨酸和天冬氨酸变成甘氨酸和谷氨酸;C39 rhl R基因序列多个位点碱基突变,其中第146位移码突变,147位替换突变,导致编码蛋白第48位以后氨基酸改变;C84 las R基因序列多个位点碱基突变,导致编码蛋白66、136、138和172位氨基酸分别由精氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和丝氨酸变成赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸和天冬酰胺;C104和C117 rhl Ⅰ基因序列多个位点碱基突变,其中第184、249位碱基突变导致编码蛋白第62、83位氨基酸由丝氨酸和天冬氨酸变成甘氨酸和谷氨酸。致病因子检测显示:C39、C84、C104、C117弹性蛋白酶表达水平低于野生株(PAO1),与QS缺陷株(PAOJP2)相近;C39、C84绿脓菌素分泌明显低于PAO1,与PAOJP2相近,C104、C117绿脓菌素分泌正常;C39、C84、C104、C117的生物被膜起始能力及泳动能力均低于PAO1。结论 QS系统在PA感染过程中发挥了非常重要的作用,干扰QS是控制PA感染非常有希望的新方法。     

黄芩苷联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的 通过在体外建立铜绿假单胞菌生物膜模型,研究黄芩苷联合头孢他啶对生物膜的协同杀菌效果.方法 选取临床分离的呼吸道铜绿假单胞菌,采用LB肉汤-吸痰管系统建立体外生物膜模型,连续稀释法进行活菌计数,微量稀释法测定药物的最低抑菌浓度(MIC).结果 15.65 mg/L的黄芩苷可抑制和破坏生物膜,并增强头孢他啶对生物膜内铜绿假单胞菌的抗菌活性.结论 黄芩苷能增强头孢他啶对生物膜内铜绿假单胞菌的清除作用.     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

黄芩苷对铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的研究黄芩苷对体外铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,Pa)生物膜(biofilm,BF)的影响。方法选取临床分离呼吸道Pa,采用LB肉汤-吸痰管系统培养BF,建立体外BF模型,银染法观察BF变化。将黄芩苷作用于BF,连续稀释法进行活菌计数,微量稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。结果 15.65mg/L的黄芩苷即可抑制和破坏BF。结论黄芩苷对体外铜绿假单胞菌生物膜有较强的抑制作用。     

呼吸道白念珠菌分离株生物膜表型差异的机制

摘要：目的探讨呼吸道白念珠菌分离株生物膜形成能力存在差异的可能分子机制。方法呼吸道白念珠菌临床分离株及标准株
ATCC90028体外粘附生长24 h形成生物膜,用XTT减低法测定其增殖情况,并分别提取生物膜态白念珠菌总RNA,用荧光定
量RT-PCR的方法测定转录因子CPH1、EFG1和粘附分子ALS3、HWP1基因的表达,采用△Ct的方法计算其相对表达量。结果
根据粘附生长的白念珠菌增殖情况,有8株临床株形成生物膜能力“高”,另7株临床株及标准株ATCC90028形成生物膜能力
“低”。生物膜表型差异的菌株间转录因子CPH1、EFG1的表达无显著差异（P>0.05）,而粘附分子ALS3、HWP1基因的表达有显
著差异（P<0.05）。结论呼吸道白念珠菌分离株生物膜形成存在表型差异,其差异的机制可能与转录因子CPH1和EFG1以外的
基因调控相关。
     

北京地区实验动物绿脓杆菌分离株MLVA分型

目的 通过多位点可变数目串联重复序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)分型方法,研究北京地区实验动物绿脓杆菌分离株基因型和分布情况.方法 选择13个可变数目重复序列(variable-number tandem-repeat,VNTR)位点,对实验动物及设施中检测出的141株绿脓杆菌的基因组DNA进行重复序列扩增,所得指纹图谱使用BioNumerics软件进行聚类分析,绘制系统发育树和最小生成树(minimum spanning tree,MST).结果 所采用的13个VNTR位点能够对全部分离株进行有效分型.141株绿脓杆菌主要被分为了3个基因群,56个基因型.各群所占比例分别为A群82.3％,B群占12.8％,C群占5.0％,辛普森多样性指数为0.763.同一区域内相邻实验动物单位的绿脓杆菌分离株同源关系较远.结论 MLVA方法对绿脓杆菌具有很好的分型能力,能够有效的追踪绿脓杆菌的来源.北京地区实验动物中绿脓杆菌分离株基因型多态性丰富,但无地域性同源关系.     

潜水人群铜绿假单胞菌基因多位点序列遗传分型

目的 研究海军潜水人群铜绿假单胞菌分离株的遗传基因型,明确海军潜水人群铜绿假单胞菌携带株的流行特征.方法 用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术、以铜绿假单胞菌7个管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE内部特定核酸片段作检测靶,对随机抽样海军潜水员携带的64株铜绿假单胞菌进行目的基因扩增和测序,应用Pseudomonas aeruginosa MLST数据库对测序结果进行分析,以获得检测靶基因的多位点序列信息;应用Bionumerics 4.0的LIAN,SplitsTree和eBURST分析程序对获得的MLST进行进一步的生物信息学分析,以获得流行株的遗传特征.结果 64株铜绿假单胞菌中53株可分为19个ST型,11株未能分型;其中ST274和ST260是优势克隆株,分别占18.75％(12/64)、15.62％ (10/64).结论 海军潜水人群携带的铜绿假单胞菌具有遗传多样性和优势基因型,MLST分型对于研究海军潜水人群携带的铜绿假单胞菌遗传差异与流行特征具有重要意义.     

白念珠菌基因多态性与耐药性关系

 【目的】探讨耐氟康唑白念珠菌基因多态性与其耐药性是否相关。【方法】收集48株敏感白念珠菌和10株耐氟康唑白念珠菌,其中包括2株体外诱导的耐氟康唑白念珠菌。选择1个随机引物(引物1251),采用任意引物PCR方法基因分型,将电泳图谱扫描入计算机后采用Labwork4.0软件转化为数值图表,利用SPSS11.5进行聚类分析。【结果】引物1251的PCR指纹图带型稳定,多态性丰富,可以作为分型引物。聚类分析结果提示8株临床耐药菌的PCR指纹图相似系数为71.7%,而其中7株的耐药菌相似系数高达86.7%,远高于58株菌的平均相似系数(47.3%)。2株体外诱导的耐药菌诱导前后基因型未发生变化。【结论】基因分型的结果未提示耐氟康唑白念珠菌存在一定的特殊电泳条带,但提示了特定的PCR指纹图可能与耐药性有一定相关性。     

泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因分型研究

目的研究从临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布及结构情况,并对其进行基因分型。方法分离自临床的57株鲍曼不动杆菌,PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1可变区,PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分型并进行测序分析可变区携带的耐药基因盒,ERIC-PCR进行基因分型。结果 49株整合酶I阳性,其中47株整合子I扩增阳性,RFLP分为2型,测序结果为aacA4-catB8-aadA1和drf17-aadA5。3株ISCR1以及ISCR1可变区扩增均阳性,可变区经RFLP分为1型,测序结果为orf513-qnrA1-ampR-qacEdeltal,ISCR1阳性菌整合子I均阳性,经ERIC-PCR检测将57株鲍曼不动杆菌分为27个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于鲍曼不动杆菌中,ISCRI携带率较低,氨基糖苷类、甲氧苄啶类和β-内酰胺类耐药基因盒较常见,ERIC-PCR可用于临床鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究。     

外科重症监护室多重耐药铜绿假单胞菌的对比基因组学研究

目的 对比分析外科重症监护室多重耐药铜绿假单胞菌的基因组差异,探索其与多重耐药性的关系.方法 琼脂稀释法检测49株铜绿假单胞菌对临床常用9种抗菌药物的敏感性,应用4种稀有位点核酸内切酶结合的脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对临床分离的株铜绿假单胞菌进行基因组分型.结果 多重耐药铜绿假单胞菌菌株占外科重症监护室铜绿假单胞菌临床分离株的85.7%;PFGE基因组型A菌株占全部铜绿假单胞菌分离株的61.2%,为主导基因组型,该基因组型全部对阿米卡星和头孢吡肟敏感,对左旋氧氟沙星和美洛培南耐药;PFGE基因组型H、P菌株对6种以上抗生素耐药;PFGE基因组型I和J菌株对所测9种抗生素均敏感.结论 4种稀有位点核酸内切酶结合的PFGE基因组分型可以作为临床多重耐药铜绿假单胞菌监控和鉴定的有效手段.