大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立

目的 建立真核细胞表达的大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统，为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受、保护移植物的作用奠定基础。方法 制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（pL0134-FasL），包装质粒（ΔNRF）及包膜蛋白质粒（VsV-G）。脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T，72h后收集病毒上清，Western-blot法检测293T细胞的FasL蛋白表达。结果 转染后的293T细胞表达FasL蛋白。结论 成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统。     

大鼠Smad7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建大鼠Smad7慢病毒载体。方法:提取大鼠大脑皮质及肾脏的总RNA,逆转录PCR扩增获得Smad7目的基因片段,EcoRI及BamHI酶切连接慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,构建融合copGFP共表达的Smad7重组质粒。转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR扩增及测序鉴定正确后,Smad7重组质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293TN,包装产生病毒液,转染H1299细胞株测定病毒滴度。结果:通过扩增获得1.3kb Smad7 cDNA片段,测序结果证实目的基因与Genebank序列完全一致,Smad7重组质粒慢病毒包装后获得Smad7慢病毒载体,病毒滴度为1.0×107ifu/ml。结论:成功构建大鼠Smad7慢病毒载体,为进一步研究Smad7基因的相关功能提供了适合的转染载体。     

腺病毒Smad 7转染对阿霉素肾病大鼠蛋白尿的影响

目的  在阿霉素（ADR）肾病大鼠模型中,探讨过表达Smad 7对肾病蛋白尿及其病理的影响。方法  本实验用单次尾静脉注射建立阿霉素肾病模型,通过构建重组腺病毒介导外源性Smad 7基因,单侧肾动脉灌注转染Smad 7至靶肾脏。用荧光显微镜检测Smad 7重组腺病毒的转染效果,用邻苯三酚红比色法测定大鼠24 h尿蛋白,HE染色检测各组肾脏病理改变。结果  ①用6.5 mg/kg ADR一次性尾静脉注射SD大鼠可成功构建肾病模型;4周末似微小病变型肾病。②单侧肾动脉灌注能有效将介导Smad 7的重组腺病毒转染至大鼠靶肾脏。③4周末肾病重组腺病毒（Ad-Smad7）组尿蛋白（38.4±6.0）较ADR组（69.58±10.63）减少（P <0.05）。④荧光显微镜显示肾病Ad-smad7组大鼠靶肾中,Ad-Smad7主要在肾小管表达,肾小球表达少。⑤肾病Ad-Smad7组肾脏病理改变轻微,肾病Ad-GFP组、ADR组病理较严重,出现类似局灶节段性肾小球硬化的慢性肾脏病病理表现。 结论  单侧肾动脉灌注有效地使重组腺病毒介导的Smad 7转染至大鼠靶肾脏,使Smad 7在该肾过表达,可减轻肾病大鼠蛋白尿,并改善阿霉素肾病病理。

     

FasL基因转染诱导大鼠肾移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨Fas配体(Fas ligand,FasL)在大鼠肾移植免疫耐受中的作用及意义.方法:首先建立大鼠同种肾移植模型.实验组供肾移植前用1ml含重组腺病毒Ad-FasL的肾脏冷保存液经肾动脉灌注;建立同种大鼠肾移植模型.分别观察电镜、免疫组织化学法、肾功能测定、生存期,比较各组间的不同.结果:Ad-FasL治疗组肾移植受体大鼠平均存活天数为31.3 d,与对照组的平均9.1 d存活时间比较,平均存活天数增加了22 d,差异显著.Ad-FasL治疗组的移植肾功能基本保持稳定,对照组在术后5 d切除对侧肾脏后血清肌酐浓度迅速上升.结论:腺病毒载体可成功介导FasL基因对大鼠肾脏的转染,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间.     

携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒在大鼠卵巢中的定位及表达

目的研究携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒在活体大鼠卵巢中感染定位及表达情况。方法将携带EGFP的慢病毒注射至实验组大鼠双侧卵巢部位,另设对照组和空白对照组,每天观察大鼠一般情况;分别于注射后第7,14,21和28天处死大鼠（每个时间点每组各2只）,取出双侧卵巢分别称重,行石蜡切片HE染色后光学显微镜下观察卵巢组织结构的变化和卵泡总数量;实验组卵巢行冰冻切片后在荧光显微镜下观察EG—FP的表达。结果3组大鼠一般情况及卵巢重量均无明显变化;行石蜡切片HE染色后,显微镜下见慢病毒注射的卵巢均未见明显的变性、坏死等病理形态学异常;实验组大鼠卵巢行冰冻切片后在荧光显微镜下观察,第7,14,21天EGFP的表达逐渐增强,至第28天开始稳定表达,感染效率可达90％以上。结论慢病毒载体能有效地转染活体大鼠卵巢而无明显毒不良反应。     

人PI3KCG慢病毒载体的构建及其在乳大鼠原代心肌细胞中的表达和初步功能检测

目的:构建含有人磷脂酰肌醇3-激酶p110γ(phosphatidylinositol 3-kinase,catalytic subunit gamma,PI3KCG)基因的慢病毒载体,鉴定其在乳大鼠原代心肌细胞中的表达并作初步功能检测。方法:利用同源重组的方法构建含PI3KCG基因慢病毒载体质粒,测序鉴定后采用脂质体转染法同慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察阳性对照组中的绿色荧光蛋白的表达,同时PCR法鉴定重组PI3KCG慢病毒质粒转染293T细胞成功,收集72 h病毒上清。培养乳大鼠原代心肌细胞,分为对照组,缺氧/复氧组,空载体阳性对照组,PI3KCG实验组,PI3KCG+Ly294002组5组,将含PI3KCG慢病毒载体的病毒液转染心肌细胞,检测各组的细胞培养上清中的乳酸脱氢酶浓度,观察预转染PI3KCG基因对心肌细胞缺氧/复氧过程中的保护作用。结果:成功构建含有PI3KCG基因的慢病毒载体质粒,并在293T细胞中成功表达。与缺氧/复氧组比较,PI3KCG组心肌细胞培养液中乳酸脱氢酶水平明显降低(P<0.01);心肌细胞的存活率、搏动频率明显升高(P<0.01)。结论:PI3KCG慢病毒载体有望成为探讨PI3K/AKT信号通路激活在防止心肌细胞缺血再灌注损伤的有效工具。     

大鼠瘦素受体RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

[目的]构建大鼠OBRb基因的RNAi慢病毒载体,并评估其对OBRb基因表达的沉寂作用。[方法]设计大鼠OBRb的siRNA靶序列,合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,退火后插入到慢病毒载体质粒pRNA-lentivector-VGFP上,构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;为了评估RNAi基因沉寂作用,将构建的慢病毒载体转染表达OBRb的C6大鼠神经胶质瘤细胞,利用Realtime PCR方法检测OBRb mRNA表达水平。[结果]将目的序列连接到慢病毒载体上,成功构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;通过PCR、电泳初步鉴定该重组体有OBRb表达,并进一步进行基因测序证实插入序列正确;成功将慢病毒载体转染到C6大鼠神经胶质瘤细胞,转染效率可达40%;荧光实时定量PCR检测OBRb基因表达量,结果干扰组的OBRb mRNA表达水平明显低于非干扰序列的对照组,可使OBRb mRNA表达量下调近80%。[结论]成功构建大鼠OBRb的RNAi慢病毒载体,为进一步的体内研究奠定了基础。     

大鼠FasL基因克隆及重组慢病毒载体pLO134-FasL的构建

目的 克隆大鼠FasL基因全长序列,构建其用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLO134-FasL,为进一步研究FasL蛋白生物学功能奠定基础.方法 根据大鼠FasL cDNA序列设计合成上、下游引物,以大鼠脾细胞提取的总RNA为模板,行RT-PCR扩增.扩增片断经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,插入慢病毒载体pLO134中并转化感受态细胞JM101.扩增后酶切鉴定,对正确的阳性克隆行DNA全序列分析.结果 RT-PCR扩增获得870 bp DNA片段,DNA序列分析结果与发表于GenBank上的序列（U03470）完全一致.结论 成功克隆大鼠FasL基因并构建其用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLO134-FasL.     

慢病毒介导大鼠卵巢基因转染的实验研究 *

目的 研究活体大鼠卵巢中慢病毒载体介导的基因转染及表达情况。方法 慢病毒载体(携带GFP的Bcl-2-HIV-I)注射大鼠卵巢实质,分别于注射后1、3、7、14、28天处死大鼠（每个时间点实验组n=2,对照组n=2,空白对照组n=2）,通过 Western-blot 电泳检测报告基因的表达。结果 实验组大鼠可见Bcl-2基因的表达,明显高于对照组和空白对照组Bcl-2基因的表达。 结论 慢病毒能有效的将外源基因导入活体大鼠卵巢而无明显毒副作用。     

靶向rPTTG的shRNA慢病毒载体构建及沉默效率评价

目的构建并筛选能高效沉默大鼠垂体瘤转化基因（rPTTG）的shRNA慢病毒重组载体。方法设计并合成4组特异性针对大鼠PTTG基因的shRNA序列将其构建到慢病毒载体pGCL GFP中;评估慢病毒重组载体在大鼠肾细胞中的转染效率并运用real time PCR技术检测各组重组载体对目的基因的沉默效果。结果PCR及测序结果显示,目的片段插入正确,重组载体构建成功,慢病毒重组载体转染效率达70%以上;4组shRNA序列均有基因敲减效果,并且第4组shRNA(4# shRNA)序列效果最为明显（＞80%）。结论成功构建了高效沉默rPTTG基因的慢病毒载体;验证了慢病毒载体作为RNAi载体工具转染效率的可靠性;实验显示4# shRNA能高效抑制内源性rPTTG基因表达。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

IRF5基因慢病毒表达载体的构建及其在巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的: 构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法: 采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PCR、双酶切和测序鉴定构建成功后,采用脂质体转染技术将表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带IRF5基因的重组慢病毒;收集病毒上清液感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用G418将非浸染的细胞致死,获得纯净的浸染细胞,即RAW264.7-IRF5细胞(实验组),并将RAW264.7-NC细胞作为对照(对照组)。分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测2组细胞中IRF5mRNA和蛋白的表达水平。结果: 重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5经PCR和酶切法鉴定构建成功;病毒上清液感染RAW264.7细胞并经G418筛选获得阳性细胞;RT-qPCR法检测,与对照组比较,实验组细胞中IRF5mRNA表达水平升高(P<0.001);Western blotting法检测,实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。结论: 成功构建携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5,IRF5基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。     

人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

摘要：目的  构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法  通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果  经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论  成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。

     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

人CCR5Delta32基因重组慢病毒载体的构建及表达

目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

慢病毒介导的 RNA 干扰沉默 MLF1IP 基在胆管癌 RBE 细胞中的表达

目的：应用慢病毒介导的 RNA 干扰技术沉默胆管癌 RBE 细胞中人髓细胞白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）基因的表达，探讨其对胆管癌细胞体外增殖的影响。方法：设计合成针对 MLF1IP 靶基因序列的 siRNA序列，进行重组慢病毒包装。与不含有 MLF1IP 基因 siRNA 序列的慢病毒分别转染胆管癌 RBE 细胞株。Real-time PCR 检测 MLF1IP 基因的 mRNA 表达，MTT 法检测细胞的增殖能力。结果：成功构建了 MLF1IP-shRNA 慢病毒质粒并进行慢病毒包装，Real-time PCR 显示实验组 MLF1IP 基因的 mRNA 相对表达量为0.15±0.02明显高于对照组为1.01±0.12。MTT 法检测实验组细胞的 OD 值对比对照组显著降低。结论：慢病毒介导的 RNA 干扰技术能有效沉默 RBE 细胞中 MLF1IP 基因的表达，并能明显抑制胆管癌细胞 RBE 的体外增殖能力。