TGFβ1和IFN—α2b对Ito细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达影响的研究

用胆总管结扎的方法制备狗肝纤维化模型，12周后取肝分离Ito细胞，并进行鉴定和培养。经用TGFβ1和IFN—α2b孵育后用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离细胞总RNA。对含有Ⅰ、Ⅱ型前胶原cDNA片段的质粒分别进行扩增和提纯，酶切后用自由引物延伸法进行地高辛标记，以制备Ⅰ、Ⅱ型前胶原探针。用此探针与Ito细胞总RNA进行斑点杂交，杂交斑点行灰度数字转换和半定量分析。结果显示，TGFβ1能够促进Ito细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达，而IFN—α2b则能明显抑制Ito细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。据此认为TGFβ1具有致纤维化作用，而IFN-α2b具有抗纤维化作用。     

扶正化瘀方药对NIH／3T3成纤维细胞增殖及胶原表达的影响

目的：观察扶正化瘀方对成纤维细胞增殖、胶原生成及胶原mRNA表达的影响，探讨该方抗肝纤维化的作用机制。方法：经口给予大鼠扶正化瘀方药(丹参、桃仁及虫草菌丝等组成)后，制备药物血清，观察药物对NIH／3T3成纤维细胞增殖、胶原生成及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。细胞增殖采用^3H—TdR掺入试验，胶原酶法检测细胞内外的胶原生成率，免疫荧光细胞化学观察细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原的表达，Ⅰ型胶原mRNA表达采用斑点杂交法。结果：(1)10%药物血清对细胞增殖的抑制率达46．87%(P<0．05)；(2)药物血清能显著抑制细胞内(P<0．05)外(P<0．01)胶原生成率及细胞胶原的表达；(3)药物能显著降低细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达量（P<0．01)。结论：抑制成纤维细胞增殖、胶原mRNA的表达及胶原的生成量是扶正化瘀方抗肝纤维化的主要作用机制之一。     

丹参对转化生长因子β_1刺激的NIH/3T3细胞表达Ⅰ型胶原和c-fos mRNA的影响

目的:观察丹参对TGFβ_1刺激的NIH/3T3成纤维细胞功能的影响。方法:将丹参灌胃给正常大鼠,分离含药血清,温育TGFβ_1刺激的成纤维细胞。RT-PCR法检测Ⅰ型胶原和c-fos的基因表达。结果:经TGFβ_1刺激后,细胞Ⅰ型胶原和c-fos的mRNA表达明显增加,丹参含药血清可分别抑制由TGFβ_1引起的细胞Ⅰ型胶原和c-fos的mRNA表达的增加,结论:丹参可能通过抑制c-fos的基因表达进而抑制Ⅰ型胶原的基因表达。     

钙拮抗剂对成纤维细胞胶原基因的影响

目的：研究钙拮抗剂汉防己甲素（Tet)、维拉帕米(Ver)和硝苯啶（Nif)对3T3成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ胶原基因表达的影响,旨在探讨其抗肝纤维化的机理。方法：应用标记Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型前胶原cDNA探针与RNA斑点印迹杂交技术,检测Tet,Ver和Nif与3T3成纤维细胞共育前后Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原mRNA水平的变化。结果：Tet,Ver和Nif与3T3成纤维细胞共育后Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原mRNA水平有不同程度降低。结论：钙拮抗剂可以抑制细胞外基质胶原基因的表达。     

活血软坚方对肝星状细胞Smad信号的影响及意义

目的 活血软坚方的成药制剂-和络舒肝含药血清对肝星状细胞(HSC)-T6细胞株Smad3、Smad17、前胶原α2(Ⅰ)基因表达影响,以探讨活血软坚方抗肝纤维化作用及分子机制。方法 常规方法制备和络舒肝含药血清。用不同浓度和络舒肝含药血清干预HSC-T6细胞株,并以逆转录聚合酶链反应观察分析各组间Smad3、Smad7、前胶原α2(Ⅰ)mRNA表达的变化,以western blot检测Smad3蛋白的表达。结果 经和络舒肝含药血清处理,可下调HSC-T6细胞株Smad3、前胶原α2(Ⅰ) mRNA表达以及Smad3蛋白表达水平,前胶原α2(Ⅰ)表达变化与Smad3表达改变趋势一致。不同浓度的含药血清作用强度明显不同,药物作用后前胶原α2(Ⅰ) mRNA表达改变呈现血药浓度依赖性(F=6.92,P<0.05)。药物血清对Smad7 mRNA表达影响不明显(F=1.57,P>0.05)。结论 活血软坚方和络舒肝的抗肝纤维化作用可能是通过非特异性作用干扰转化生长因子β和Smad功能,抑制前胶原α2(Ⅰ) mRNA转录,从而减少细胞外基质生成。对Smad3而言,可能其表达升高产生的是促纤维化形成效应,反之,表现为抗纤维化作用。     

扶正化瘀方对3T3细胞增殖和胶原生成的影响

目的:探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。方法:以体外培养的NIH/3T3细胞作为肝脏成纤维细胞的替代模型,用扶正化瘀方药物血清,以10％的浓度被添加到培养液中,通过[~3H]-TdR掺入法和免疫细胞化学,观察药物血清对3T3细胞[~3H]-TdR掺入量和胶原生成的影响。结果:药物血清组[~3H]-TdR掺入量明显少于正常大鼠血清组。药物血清组Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原量均明显低于正常大鼠血清组,其中Ⅰ、Ⅲ型胶原更为显著。结论:扶正化瘀方药物血清明显抑制了3T3细胞增殖和胶原的生成。这可能是该方抗肝纤维化的机制之一。     

丹参对转化生长因子β1刺激的NIH／3T3细胞表达Ⅰ型胶原和c—fos mRNA的影响

目的观察丹参对TGFβ1刺激的NIH/3T3成纤维细胞功能的影响.方法将丹参灌胃给正常大鼠,分离含药血清,温育TGFβ1刺激的成纤维细胞.RT-PCR法检测I型胶原和c-fos的基因表达.结果经TGFβ1刺激后,细胞I型胶原和c-fas的mRNA表达明显增加,丹参含药血清可分别抑制由TGFβ1引起的细胞I型胶原和c-fos的mR-NA表达的增加,结论丹参可能通过抑制c-fos的基因表达进而抑制I型胶原的基因表达.     

干扰素α和甘草酸对肝纤维化鼠星状细胞胶原代谢的影响

动物实验证实干扰素α和甘草酸均可降低肝纤维化鼠星状细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ表达，减少Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝脏的沉积［１，２］。但对两药联合应用治疗肝纤维化及其机制尚缺乏研究，本研究旨在观察联合应用甘草酸和干扰素α对不同阶段肝纤维化鼠星状细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶ｍＲＮＡ表达和肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积的影响，以指导临床用药。 一、材料与方法 １．动物分组及模型复制：雄性ＳＤ大鼠，体重 ２５０ｇ左右，采用四氯化碳和乙醇复制肝纤维化鼠模型。将动物分为正常对照组、模型对照组、甘草酸治疗组、干扰素治疗组和干扰素＋甘…     

丹参对转化生长因子β1刺激的NIH/3T3细胞表达I型胶原和c-fos mRNA的影响

目的:观察丹参对TGFβ1刺激的NIH/3T3成纤维细胞功能的影响.方法:将丹参灌胃给正常大鼠,分离含药血清,温育TGFβ1刺激的成纤维细胞.RT-PCR法检测I型胶原和c-fos的基因表达.结果:经TGFβ1刺激后,细胞I型胶原和c-fas的mRNA表达明显增加,丹参含药血清可分别抑制由TGFβ1引起的细胞I型胶原和c-fos的mR-NA表达的增加,结论:丹参可能通过抑制c-fos的基因表达进而抑制I型胶原的基因表达.     

IH764—3抗肝纤维化作用的实验研究

目的：研究IH764-3的抗肝纤维化作用，为临床应用提供实验依据。方法：①用四氯化碳复制大鼠肝纤维化模型，观察IH764—3的防治作用；②分离、培养大鼠贮脂细胞，观察IH764—3对其增殖和胶原合成的影响。结果：①IH764-3可显著抑制大鼠肝纤维化程度,能明显降低肝脏羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA含量，降低血清透明质酸、层粘连蛋白水平，改善肝功能。组织学检查亦显示其具有抗肝纤维化作用；②IH764—3可显著抑制大鼠贮脂细胞增殖和胶原的合成，并呈时间、剂量依赖性关系。结论：IH764-3在体内外均具有抗肝纤维化作用，它对于防治肝纤维化可能具有临床应用前景。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

肝纤维化大鼠肝星状细胞和肝细胞胶原表达特征的实验研究

目的:探讨肝星状细胞和肝细胞在肝纤堆化时过量合成肝脏胶原的作用、特征及中药抗纤复方减少胶原生成的作用机理。方法:以二甲基亚硝胺(DMN)复制大鼠肝纤维化动物模型,采用胶原酶消化法经门静脉灌注0.05％Ⅳ型肢原酶灌流液消化肝脏,分散肝脏细胞。分别以18％(w/v)Nycodenz和49.2％(V/V)淋巴细胞分离液为介质行密度梯度离心,分离正常大鼠和造模大鼠肝脏星状细胞和肝细胞,按TRIzol试剂盒提供的方法抽提大鼠肝脏组织和细胞总RNA,经甲醛变性凝胶电泳,转印至尼龙膜,以地高辛标记的α_1(Ⅰ)、α_1(Ⅲ)、α_1(Ⅳ)前肢原探针行Northern印迹分子杂交,检测星状细胞、肝细胞和肝脏组织α_1(Ⅰ)、α_1(Ⅲ)和α_1(Ⅳ)前肢原mRNA的表达特征。对造模大鼠以抗纤复方药液灌胃,以秋水仙碱治疗对照组大鼠,治疗后再分离星状细胞和肝细胞行肢原基因表达检测。结果:正常大鼠肝脏α_1(Ⅰ)、α_1(Ⅲ)和α_1(Ⅳ)首胶原mRNA均有少量表达,造模组大鼠肝脏前胶原mRNA表达量明显增加,α_1(Ⅰ)与α_1(Ⅲ)前胶原mRNA表达量接近,α_1(Ⅳ)前肢原mRNA稍低。正常组大鼠肝星状细胞3种前胶原mRNA少量表达,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量接近,Ⅳ型首肢原mRNA较少。造模组大鼠星状细胞3种前胶原mRNA表达增加,其中以Ⅰ型mRNA表达稍多,Ⅲ型mRNA次之,Ⅳ     

三七总皂苷对肝纤维化大鼠胶原及TGF-β_1 mRNA表达的影响

目的从mRNA水平观察三七总皂苷对肝纤维化大鼠Ⅰ型前胶原及TGF-β1的影响。方法用四氯化碳复合因素诱导大鼠肝纤维化模型。同时给予三七总皂苷治疗,秋水仙碱治疗组作对照,病理HE染色观察纤维化程度分期,用RT-PCR进行Ⅰ型前胶原mRNA和TGF-β1mRNA的半定量检测。结果三七总皂苷能抑制肝纤维化大鼠Ⅰ型前胶原及TGF-β1的合成表达,减轻肝纤维化程度。结论三七总皂苷具有抗肝纤维化作用,干预大鼠肝纤维化可能与减少TGF-β1含量有关。     

复方861对大鼠肝星状细胞胶原合成及降解干预作用的体外研究

目的深入研究中药复方861抗肝纤维化的机理。方法向传一代肝星状细胞培养液中加入终浓度为10mg／ml的复方861作用48小时,收获细胞培养液观察Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原及TGFβ1的分泌量并测定胶原酶活性;收获肝星状细胞并提取总RNA,斑点杂交法检测胶原、胶原酶及其抑制TIMP1mRNA水平的变化。结果复方861可明显抑制肝星状细胞Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原及TGFβ1mRNA的表达及相应蛋白的分泌,同时可提高间质性胶原酶的活性并抑制TIMP1mRNA的表达。结论复方861在抑制胶原过度合成的同时,又可促进胶原的降解,从而使二者间的失衡得以纠正,达到抗肝纤维化的目的。     

ⅩⅧ型胶原mRNA在实验性肝纤维化大鼠肝脏中的表达

目的了解XⅧ型胶原（collagenXⅧ,CXⅧ）mRNA在实验性肝纤维化中的定量改变。方法以逆行胆管硬化注射加结扎的方法制备大鼠胆管堵塞性肝纤维化模型,以假手术组大鼠为对照组。提取肝脏总RNA,以核酸酶保护分析（RNA酶保护分析）定量测定前胶原α1（XⅧ）mRNA水平,并与α1（Ⅰ）和金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP－1）的mRNA变化相比较。结果与假手术组大鼠相比,胆管堵塞性肝纤维化大鼠肝脏前胶原α1（Ⅰ）及TIMP－1mRNA水平分别升高20倍及4倍;而肝纤维化大鼠肝脏前胶原α1（XⅧ）mRNA水平仅升高到1.8倍。结论肝纤维化时肝脏XⅧ胶原仅轻度升高．这种变化类型可能和XⅧ胶原主要由肝实质细胞表达有关。     

甘草酸减少鼠肝纤维化Ito细胞IⅢ型前胶原mRNA表达和胶原沉积

目的:观察甘草酸对鼠肝纤维化时Ito。细胞增殖和IⅢ型前胶原mRNA表达和肝脏胶原沉积的影响。方法:以CCl_4复制肝纤维化模型,动物分组为止常对照组,模型对照组及甘草酸治疗组三个大组,各组又包括早(2周),中(6周)。晚(9周)期组,分别于用药后第2、6、9周处死动物,分离提取肝Ito细胞,培养两周后提取总RNA,以DIG High-Prlmer去标记IⅢ型前胶析和间质胶原酶cDNA探针,Northern杂交分析IⅢ型前胶原和间质胶原酶mRNA表达.鼠肝IⅢ型胶原沉积用Dot blot测定,用~3H-TDR~3H-脯氨酸观察甘草酸对培养的Ito细胞增殖和胶原合成的影响 结果,甘草酸对Ito细胞H-TDR和H-脯氨酸的掺入在4h、24h、48h与空白对照比呈明显抑制作用(P<0.05),其抑制率分别为15％、21％、31％,在甘草酸浓度≤0.125μg/ml时,对Ito细胞~3H-TDR掺入抑制不明显,而≥0.25μg/ml时呈现明显抑制作用(P<0.05),对H脯氨酸掺入,在甘草酸浓度≥0.125μg/ml时,则出现明显抑制作用(P<0.05),且随浓度增加而抑制作用加强。在鼠肝纤维化早、中、晚各期,模型对照组Ito细胞IⅢ型前胶原mRNA表达均高于正常对照组(P<0.05),甘草酸组各期Ito细胞IⅢ型前胶原mRNA表达与模型对照组比均显著降低(P<0.05).Ito细胞间质胶原酶mRNA表达.在早、中期模型对照组均高于正常对照组(P<0.05     

甘草酸对成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的抑制作用

甘草酸在我国已广泛用于治疗慢性肝炎，它可有效地降低ALT，改善临床症状，使部分病例e抗原[1]及HBVDNA转阴；减轻炎细胞浸润及肝细胞坏死。还观察到有明显的防治大白鼠实验性肝纤维化的作用[2]。本研究从分子水平研究甘草酸对成纤维细胞胶原基因的表达，以期从细胞及分子水平阐述甘草酸的抗纤维化作用机制，为临床用于慢性肝病的治疗提供更多的理论基础。材料与方法NIH3T3细胞株（购自中科院上海细胞所）共分四组，每组重复3瓶。第一组为对照组，第二～四组为实验组。实验组在细胞接种24，。时后，分别加入川、100、1000ng／ml的甘草…     

Smad7质粒转染对肝星形细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因表达的影响

目的:研究上调Smad7表达对肝星形细胞(HSC)α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因转录的作用.方法:应用Fugene6介导Smad7质粒转染体外培养的HSC-T6细胞.继续培养48 h.同时使用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR),逆转录酶链式反应(RT-PCR)方法检测Smad7质粒组和正常对照组、空载质粒对照组α(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.结果:与正常对照组和空载质粒对照组相比,Smad7质粒转染HSC-T6细胞48h后,Smad7 mRNA水平显著增高(1.29±0.18 vs 0.11±0.02,0.13±0.02,均P<0.01),α1(Ⅰ)前胶原mRNA表达明显下降(0.10±0.01 vs 1.18±0.15.1.07±0.12,均P<0.01),但α1(Ⅲ)前胶原基因表达无明显改变(0.72±0.00 vs 0.70±0.01,0.75±0.0l,均P>0.05).结论:Smad7能明显抑制HSC细胞α1(Ⅰ)前胶原mRNA转录.     

软肝缩脾丸对肝纤维化大鼠TIMP-1、2及工、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白表达的影响

目的观察软肝缩脾丸对纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶组织抑制因子-1、2(TIMP-1、TIMP-2)及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白表达的影响,从胶原降解的角度探索中药抗肝纤维化的可能机理.方法制备大鼠肝纤维化模型,并给予软肝缩脾丸治疗;用原位杂交和免疫组化的方法分别测定TIMP-1、TIMP-2及Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达.结果CC14模型组TIMP1、TIMP-2,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白水平明显高于治疗组.正常组大鼠肝组织无一例阳性.结论TIMP-1、TIMP-2与肝纤维化形成密切相关,软肝缩脾丸可以抑制纤维化肝脏TIMP-1、TIMP-2的表达,从而增强间质胶原酶的活性,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解,产生抗肝纤维化作用.     

甘草酸对转化生长因子β1刺激肝星状细胞信号传导的作用

目的探讨甘草酸对转化生长因子β1(TGF β1)刺激大鼠肝星状细胞(HSC)胞内信号传导通路的作用。方法体外分离、培养大鼠肝HSC,甘草酸与TGFβ1刺激的HSC共同孵育。逆转录聚合酶链反应法检测1-1000 μmol/L甘草酸对TGF β1刺激的HSC中Smad2、3、7 mRNA的表达;Western印迹法检测1-1000μmol/L甘草酸对TGF β1刺激的HSC中Smad2、3、7蛋白及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平。结果TGFβ1促进HSC中Smad2、3、7 mRNA及蛋白的表达,同时促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。1-1000μmol/L甘草酸抑制Smad2、3、7 mRNA及蛋白的表达,并且抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,均呈剂量依赖性。结论甘草酸可能通过干预大鼠HSC中TGFβ信号通路而减少胶原合成和发挥抗纤维化作用。