釉基质蛋白（EMPs）对大鼠牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）对大鼠牙髓干细胞（rat Dental Pulp Stem Cells,rDPSCs）体外增殖分化能力的影响。方法：酶消化培养法获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法分离纯化大鼠牙髓干细胞,形态学观察,计算细胞克隆形成率。乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs进行诱导,利用四唑盐比色法（MTD检测和分析诱导后细胞增殖活性的变化。检测诱导后培养液中的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）。免疫组化染色和RT-PCR方法检测牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein,DSP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrixprotein 1,DMP—1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein,DSPP）的mRNA表达。结果：大鼠牙髓干细胞呈集落状生长,在体外具有一定的克隆形成能力。EMPs对大鼠牙髓干细胞的增殖有促进作用,并呈现剂量和时间依赖性。200gg／ml EMPs组可显著促进大鼠牙髓干细胞的增殖。EMPs作用组能显著提高大鼠牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性。经细胞因子刺激后细胞表达DSP、DMP-1蛋白和DSPP mRNA。结论：EMPs在大鼠牙髓干细胞增殖和向成牙本质细胞分化方面具有积极的作用。     

程序性坏死特异性抑制剂-1对高糖环境下牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨程序性坏死特异性抑制剂-1（Nec-1）对高糖环境下牙周膜干细胞（PDLSC）的增殖和成骨分化的影响。 方法体外克隆培养的PDLSC，按照如下处理方法分为3组：对照组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）和高糖+Nec-1组（25 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L Nec-1）。通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞坏死性凋亡相关分子RIP1、RIP3的表达，噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞增殖活力，通过茜素红染色、碱性磷酸酶（ALP）定量检测和实时荧光定量PCR等方法分析PDLSC的成骨分化情况。使用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较各组间细胞增殖活力（MTT吸光度A值）、ALP表达含量及成骨相关基因（COL1、RUNX2、OCN）相对表达水平，并用LSD-t检验进行组间多重比较。 结果Western blot结果显示，高糖组PDLSC的RIP1和RIP3的表达较对照组明显增加，而高糖+Nec-1组的RIP1和RIP3的表达明显弱于高糖组。PDLSC培养7 d后，高糖组增殖活力较对照组明显降低，其吸光度A值（0.67 ± 0.06）显著低于对照组（1.23 ± 0.12），差异有统计学意义（t = 9.652，P<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的增殖活力明显增加，高糖+Nec-1组吸光度A值（1.12 ± 0.11）显著高于高糖组（0.67 ± 0.06），差异有统计学意义（t = 8.185，P<0.001）。经矿化诱导后，高糖组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（3.42 ± 0.37）和成骨相关基因COL1（1.86 ± 0.16）、RUNX2（1.55 ± 0.23）、OCN（1.08 ± 0.20）的相对表达量均较对照组均显著减少，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.149，t_COL1 = 14.257，t_RUNX2 = 7.593，t_OCN = 8.606，P均<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的成骨分化增加，高糖+Nec-1组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（6.06 ± 0.26）和成骨相关基因COL1（3.64 ± 0.30）、RUNX2（2.53 ± 0.26）、OCN（2.14 ± 0.30）的相对表达量较高糖组均显著升高，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.033，t_COL1 = 11.636，t_RUNX2 = 6.332，t_OCN = 6.573，P均<0.001）。 结论体外培养条件下，高糖环境抑制了PDLSC的增殖和成骨分化，而Nec-1明显改善了高糖环境下PDLSC的增殖和成骨分化。     

核心结合因子α1诱导人牙乳头细胞矿化的相关蛋白表达

目的 在人牙乳头细胞中探讨核心结合因子α1(core binding factor α1，cbfal)能否调控矿化相关蛋白的表达。方法 体外培养人牙乳头细胞，转染peDNA3-cbfal重组质粒，稳定表达cbfal后检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素(osteoealcin，OC)含量，同时采用免疫组化、免疫印迹和PCR等方法观察骨桥素(osteopontin，OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨连素(osteonectin，ON)、牙本质基质蛋白(dentin matrix protein 1，DMP1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphopmtein，DSPP)的表达。结果 建立了稳定表达cbfal基因和蛋白的人牙乳头细胞模型PC-3，发现转染后细胞的ALP和OC含量明显增高，OPN、BSP、ON、DMP1的表达也明显增高，但未发现牙本质特异性蛋白DSP及其编码基因DSPP的表达。结论 在人牙乳头细胞中，cbfal能上调ALP和OC含量，诱导多种矿化组织特异性蛋白的表达，在牙齿发育矿化中有重要作用，提示它与牙乳头细胞分化为成牙本质细胞的启动有关。     

永生化成牙本质细胞表达牙本质基质蛋白的实验研究

目的　探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l表达牙本质基质蛋白的情况。方法　矿化液培养hTERT-hOd-l细胞5周,检测骨钙素(OC)分泌量和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用免疫组织化学、RT-PCR和原位杂交方法检测Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)以及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP) 和牙本质涎蛋白(DSP)在细胞中的表达。结果　在矿化液诱导下,hTERT-hOd-l细胞ALP活性和OC分泌量升高。 hTERT-hOd-l细胞在mRNA水平上表达BSP、DMP1和DSPP,在蛋白质水平上表达DSP和Ⅰ型胶原。结论　hTERT- hOd-l细胞在体外表达牙本质基质蛋白,具有矿化的潜能。     

Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞牙/骨向分化的影响

目的 探讨Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla, SCAPs)的牙/骨向分化的影响。方法 分离培养SCAPs,流式细胞术对SCAPs进行表面分子鉴定,检测Tideglusib对SCAPs细胞增殖是否有影响。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和ALP染色筛选Tideglusib促进SCAPs表达ALP活性的最佳浓度。用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)模拟炎性微环境刺激SCAPs。采用Western blot及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)和基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)表达变化。结果 CCK-8实验显示:Tideglusib浓度低于50 nmol/L时对细胞增殖无抑制作用;1 nmol/L Tideglusib处理LPS刺激的SCAPs,其ALP活性增加最明显;Western blot及qRT-PCR实验显示:1 nmol/L Tideglusib处理后的LPS刺激的SCAPs其成骨/成牙相关蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)和基因的表达(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)均明显上调(P<0.05)。结论 1 nmol/L Tideglusib可以促进LPS刺激的SCAPs的牙/骨向分化能力。     

犬牙周膜细胞和骨髓基质细胞相互作用的体外实验研究

目的:研究牙周膜细胞(PDLCs)和骨髓基质细胞(BMSCs)共培养是否更利于牙周组织再生。方法 :用组织块法培养PDLCs,用全血贴壁法培养BMSCs,检测它们的成骨、成脂诱导分化能力。用Transwell小室共培养这两种细胞,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测共培养后这两种细胞的增殖能力及部分基因的表达变化。结果:PDLCs和BMSCs具有多向分化潜能。共培养能促进它们各自增殖,上调Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、核心结合因子2(RUNX2)的表达。结论:PDLCs和BMSCs共同运用作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

年龄因素对人牙周膜干细胞生物学行为影响的研究

 目的　研究年龄因素对人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）生物学行为的影响。方法  选取2017年10月至2018年10月于青岛市口腔医院口腔外科就诊的因阻生齿或正畸需要拔除牙齿的患者18例，根据不同年龄段分为3组，分别为A组（18 ~ 20 岁）、B组（30 ~ 35岁）、C组（50 ~ 55岁），每组6例。原代培养人PDLSC，采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色、MTT法检测各组细胞衰老程度和增殖能力。成骨诱导人PDLSC，采用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测各组细胞的成骨分化能力。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组多能性相关转录因子Nanog和Sox2的表达水平。结果　各组均成功原代培养出人PDLSC，经衰老相关β-半乳糖苷酶染色发现，A组阳性染色细胞率最低、B组次之、C组最高，组间差异均有统计学意义（均P < 0.05）。通过MTT法检测发现，不同年龄组OD值比较，差异有统计学意义（F = 22.354，P = 0.009），且各组OD值均随着培养时间的延长而增大（F = 28.367，P = 0.018），年龄与时间之间有明显的交互作用（F = 26.431，P = 0.015）。ALP染色和茜素红染色均发现，A组染色面积百分比大于B组和C组，B组染色面积百分比大于C组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。qRT-PCR结果显示，A组Nanog和Sox2的相对表达量均高于B组和C组，B组Nanog和Sox2的相对表达量高于C组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。结论　随着年龄增加，衰老的人PDLSC增多，其增殖能力、成骨分化能力以及多能性相关转录因子的表达水平也显著下降。     

年龄因素对人牙周膜干细胞生物学行为影响的研究

目的　研究年龄因素对人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSC）生物学行为的影响。方法  选取2017年10月至2018年10月于青岛市口腔医院口腔外科就诊的因阻生齿或正畸需要拔除牙齿的患者18例,根据不同年龄段分为3组,分别为A组（18 ~ 20 岁）、B组（30 ~ 35岁）、C组（50 ~ 55岁）,每组6例。原代培养人PDLSC,采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色、MTT法检测各组细胞衰老程度和增殖能力。成骨诱导人PDLSC,采用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测各组细胞的成骨分化能力。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组多能性相关转录因子Nanog和Sox2的表达水平。结果　各组均成功原代培养出人PDLSC,经衰老相关β-半乳糖苷酶染色发现,A组阳性染色细胞率最低、B组次之、C组最高,组间差异均有统计学意义（均P < 0.05）。通过MTT法检测发现,不同年龄组OD值比较,差异有统计学意义（F = 22.354,P = 0.009）,且各组OD值均随着培养时间的延长而增大（F = 28.367,P = 0.018）,年龄与时间之间有明显的交互作用（F = 26.431,P = 0.015）。ALP染色和茜素红染色均发现,A组染色面积百分比大于B组和C组,B组染色面积百分比大于C组,差异均有统计学意义（均P < 0.05）。qRT-PCR结果显示,A组Nanog和Sox2的相对表达量均高于B组和C组,B组Nanog和Sox2的相对表达量高于C组,差异均有统计学意义（均P < 0.05）。结论　随着年龄增加,衰老的人PDLSC增多,其增殖能力、成骨分化能力以及多能性相关转录因子的表达水平也显著下降。     

牙周膜成纤维细胞对成骨细胞细胞数量和碱磷酶活性的影响

目的:观察人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast cells,HPLFs)对成骨细胞(Osteoblast cells,OBs)细胞数量和碱磷酶活性的影响,为进一步探讨正畸牙齿移动的生物学机制奠定基础。方法:建立人OBs与HPLFs共培养系统,通过细胞计数及生化检测法观察人牙周膜成纤维细胞对成骨细胞细胞数量和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性的影响。结果:3d和5d时,共培养组OBs细胞计数分别为4.5×104及8.5×104,明显高于对照组,且两组分别与对照组OBs细胞计数有显著性差异(P<0.05)。transwell共培养组与对照组相比,在3d时,两组OBsALP活性有显著性差异(P<0.05),5d及7d时差异尤其显著(P<0.01),transw ell共培养组OBsALP活性低于对照组。结论:人HPLFs能增加OBs的细胞数量,但抑制OBsALP活性。     

3种髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞毒性的体外研究

目的对三氧化矿物凝聚体（MTA）、Z350纳米复合树脂、银汞合金3种常用髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）毒性进行体外比较研究。方法采用甲基噻唑基四唑（MTT）法研究3种材料对HPDLF增殖的影响,并采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法研究材料对细胞碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OC）mRNA表达的影响。结果MTA的毒性最小,并能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达;Z350的毒性级为1级,能够促进细胞ALP mRNA的表达,对细胞OC mRNA的表达基本无抑制;银汞合金对细胞增殖的抑制作用最大,毒性级为3级,具有中度细胞毒性,对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制最强。结论MTA对HPDLF的毒性最小,并且能促进HPDLF的成骨功能和分化,Z350纳米复合树脂次之,银汞合金的毒性最大,并抑制牙周膜成纤维细胞的分化。     

改良法分离培养人牙周膜干细胞

目的 改良法体外分离培养人牙周膜干细胞(PDLSC),并进行鉴定.方法采用酶消化组织块法获得人牙周膜细胞,通过有限稀释法克隆化培养、分离得到PDLSC,用含10%FBS的α-MEM培养液培养并传代:测定克隆形成率:免疫组织化学检测角蛋白及波形蛋白表达:流式细胞术分析细胞周期及表面标志物STRO-1、CD146的表达;并...